低能离子注入与Co γ辐照小麦成熟胚诱发反转录转座子WIS2-1A变化的研究

摘要

目的：低能N+和60Coγ射线在诱变育种应用上已经取得了较好的成效，但对于诱变效应的机理研究相对滞后。本实验以小麦中反转录转座子WIS2-1A为研究对象，将用于诱变育种的物理诱变源低能N+和60Coγ射线应用到反转录转座子的研究上。从DNA及cDNA水平初步探讨了低能离子辐射及60Coγ射线对WIS2-1A反转录酶的基因及表达的影响。然后以其中WIS2-1A表达大幅度提高的样本为研究对象，用基因芯片的方法研究其整个转录本的表达变化情况，并据此推断这些表达变化与反转录转座子WIS2-1A表达之间的相关关系，推测辐射引起生物学效应的可能原因及反转录转座子WIS2-1A在其中的作用，为辐射诱变生物学效应的机理研究奠定基础。
　　 结论：
　　 1.本研究以各种剂量低能N+和60Coγ射线辐照小麦种子，发现经过处理的种子培养30 h、45 h和60 h后，胚中的反转录转座子WIS2-1A反转录酶的保守序列在DNA水平没有太大变化。与Genebank中标准序列相比，低能N+注入的小麦种胚中WIS2-1A反转录酶的保守序列变化相对较大。
　　 2.1.0×1017N+/c㎡注入的小麦种子培养45 h时，种胚中WIS2-1A反转录酶保守序列克隆中，发现一个克隆序列在187-195bp处缺失了9个碱基（AGTGAGTGG）。将其翻译成氨基酸序列，发现其中有6个终止子。这种缺失突变和终止密码子突变可能是造成反转录转座子异质性的主要原因。
　　 3.实时定量PCR结果表明，不同剂量低能N+注入和60Coγ射线处理的种胚中，都发现WIS2-1A有持续低水平的表达，且WIS2-1A表达活性随着种子培养时间延长而下降。60 Coγ辐照能够小幅度地刺激或抑制WIS2-1A表达，影响相对较小且没有规律性；低能N+注入对WIS2-1A表达影响较大，且WIS2-1A表达变化与低能N+注入剂量之间有一定规律性。种子培养30 h时，这种剂量依赖关系表现尤其明显：随着注入剂量增大，WIS2-1A表达呈现先增加后降低的趋势，在0.5×1017N+/c㎡表达达到最大值，即相对表达量是对照的138倍。
　　 4.从基因芯片结果看，受到0.5×1017N+/c㎡低能N+注入刺激的小麦种子，在培养30 h时，呼吸作用增强，碳水化合物和蛋白质的水解加快而合成减慢，低温及高温应激蛋白、抗病及抗逆蛋白明显增多。据此推断，0.5×1017N+/c㎡低能N+注入对小麦种胚细胞造成了某些伤害，经过30 h培养，细胞正处于主动的抗逆状态。
　　 5.小麦种子受到0.5×1017N+/c㎡低能N+注入刺激后，与对照相比，细胞内抗逆基因和反转录转座子WIS2-1A的表达都显著提高。推断胁迫条件下，反转录转座子激活与防卫基因激活之间可能存在相似的分子机理。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 植物反转录转座子及WIS2-1A研究进展

1植物反转录转座子研究进展

1.1反转录转座子的分布及分类

1.2植物反转录转座子的特点

1.3植物反转录转座子在基因组中的作用

2 WIS2-1A的研究进展

2.1 WIS2-1A发现、结构和分布

2.2 WIS2-1A与小麦中其他反转录转座子关系

2.3 WIS2-1A研究进展

第二章 低能离子注入与60Coγ辐照诱变育种研究进展

1低能离子注入诱变育种研究

1.1低能离子束诱变育种研究进展

1.2低能离子束诱变机理研究

2 60Coγ辐照诱变育种研究进展

2.1 γ射线诱变育种研究进展

2.2 γ射线诱变机理研究

3本论文研究的目的及意义

第三章 低能离子注入与60Coγ辐照小麦成熟胚WIS2-1A反转录酶序列分析

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 WIS2-1A反转录酶序列的检测

2.2 Genebank中WIS2-1A反转录酶保守区段分析

2.3 WIS2-1A反转录酶基因长度、同源性、碱基变化比较

2.4 WIS2-1A反转录酶的核苷酸序列和氨基酸序列比较

3讨论

第四章 低能离子注入与60Coγ辐照小麦成熟胚诱发WIS2-1A表达的时效与量效

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1提取总RNA甲醛琼脂糖电泳图

2.2 18s rRNA与WIS2-1A基因的实时定量PCR熔解及扩增曲线

2.3低能N+注入对WIS2-1A表达的时间效应

2.4 60Coγ辐照对WIS2-1A表达的时间效应

2.5低能N+注入对WIS2-1A表达的剂量效应

2.6 60Coγ辐照对WIS2-1A表达的剂量效应

3讨论

第五章 低能离子处理的表达谱分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 RNA质量控制

2.2处理组和对照组中已知基因的表达情况

2.3差异表达基因/转录本倍数分布

2.4上调/下调大于2倍的差异表达基因分类分析

3讨论

结论

参考文献

博士期间发表学术论文

致谢