肾母细胞瘤细胞株与正常胚肾细胞株microRNA表达谱的差异

摘要

背景和目的
　　 肾母细胞瘤又称Wilms瘤，是小儿最常见的泌尿系统肿瘤，占小儿实体肿瘤的8％小儿泌尿系统肿瘤的80％。它来自多能干肾细胞前体，产生未分化胚细胞、原始上皮与间质组织等。肾母细胞瘤是亚急性限期手术病种，近年在治疗方面取得很大进步，通过手术加化疗及配合放疗综合手段，术后存活率约80％-90％，但另外约20％患者会发生肿瘤复发导致死亡。因此，深入了解肾母细胞瘤发病机制，在此基础上探索早期诊断和治疗方法有重要意义。
　　 MicroRNA(miRNA)为长约19-22nt非蛋白质编码RNA短序列片段。主要功能是在转录后水平调控mRNA的翻译。miRNA通过5’端7-8nt种子区与靶基因mRNA3’端非翻译区(UTR)特殊序列互补结合调节靶基因mRNA翻译。研究表明microRNA通过调控下游靶基因作为癌基因或抑癌基因。致癌性microRNAs通过靶向作用肿瘤抑制基因、细胞凋亡基因或细胞分化基因促进肿瘤形成与发展；抑癌性microRNA则是通过抑制癌基因、抗细胞凋亡基因或细胞增殖基因阻止肿瘤形成与发展。不同肿瘤有不同组合miRNAs异常表达谱，说明肿瘤miRNAs表达谱具有其组织特异性。体内miRNAs与mRNA之间存在相互作用，一个miRNA可以有多个靶基因，一个靶基因也可以由多个miRNA调节，这些作用交织在一起形成了复杂调节网络导致肿瘤形成。因此，了解肾母细胞瘤总miRNAs异常表达谱是研究肾母细胞瘤发病机制的基础。方法
　　 肾母细胞瘤G401细胞株和正常胚肾CCC-HEK-1细胞株均购自北京协和细胞资源中心，以G401和CCC-HEK-1细胞株为实验组和对照组，各3个样本。Trizol法抽提总RNA，紫外分光光度计测定吸光度值D(260)、D(280)、D(230)和变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量和浓度，采用Exiqon公司microRNA芯片(11.0)，筛选miRNAs差异表达谱，并对差异表达的基因进行聚类分析。
　　 为了进一步验证microRNA芯片结果的可靠性，我们挑选出10个具有代表性差异表达miRNAs分子，过表达的hsa-miR-387、hsa-miR-18b、hsa-miR-183、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-214、hsa-miR-130a和低表达的hsa-miR-143、hsa-let-7f、hsa-miR-886-5p、hsa-miR-125b，采用实时定量PCR方法进行验证，用U6作为内参所得数据采用2-△△CT方法进行分析。结果
　　 用microRNA芯片筛选出差异表达显著改变（上调或下调2倍以上）的miRNAs130个，其中上调2倍以上miRNAs分子71个，表达上调4倍以上miRNAs分子27个，表达上调10倍以上miRNAs分子5个，其中上调10倍以上miRNAs为hsa-miR-1255b、hsa-miR-378、hsa-miR-190、hsa-miR-421和hsa-miR-18b；表达下调2倍以上miRNAs分子59个，下调4倍以上miRNAs分子20个，下调10倍以上miRNAs分子9个，其中下调10倍以上miRNAs为hsa-miR-143、hsa-miR-377、hsa-let-7f、hsa-miRPlus-F1158、ebv-miR-BHRF1-2、hsa-miRPlus-F1205、hsa-miRPlus-A1087、hsa-miR-342-5p和hsa-miR-155。总体上G401和CCC-HEK-1之间差异性表达显著。
　　 我们挑选出的10个差异表达miRNAs分子hsa-miR-378、hsa-miR-18b、hsa-miR-183、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-214、hsa-miR-130a、hsa-miR-143、hsa-let-7f、 hsa-miR-886-5p和hsa-miR-125b，经实时定量PCR方法验证，2△△CT值分别是1.98、4.47、1.96、2.69、6.45、2.48、0.53、0.07、0.15和0.66。结论
　　 研究结果表明肾母细胞瘤G401细胞株和正常胚肾CCC-HEK-1细胞株中miRNAs差异表达显著，并且其中miR-17、miR-18a、miR-19b、miR-20a、miR-190、miR-183、miR-30d、miR-143、miR-377、let-7f、miR-378和miR-421等已经被证实与肿瘤的发展与转移有关，表明miRNAs在肾母细胞瘤形成和转移中具有关键作用。
　　 采用Real-time PCR方法验证差异表达miRNAs，结果与miRNA芯片结果一致，说明miRNA芯片结果真实可靠是一种快速有效检测差异表达miRNAs的方法。

目录

文摘

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中英文缩略词表

肾母细胞瘤细胞株与正常胚肾细胞株microRNA表达谱的差异

第一章 引言

第二章 材料和方法

第三章 结果

第四章 讨论

参考文献

综述 miRNA在癌症中的研究

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