佛波酯类化合物联合抗白血病药物对K562细胞的影响

摘要

研究背景与目的:
　　 白血病是造血系统的恶性肿瘤。目前临床上应用的白血病治疗的药物很多,有一部分能够显著提高白血病的缓解率。但是由于严重的不良反应、个体差异和耐药性的产生,使大部分抗白血病药物的疗效很不理想。近年来,诱导分化剂的出现让我们看到了新的希望,有一些药物的疗效得到了肯定,许多诱导分化剂只对一种或少数几种类型的白血病敏感,在临床的使用中受到了很大的限制。因此,开发能够增加白血病疗效、减少毒副反应和耐药性的新药或联合治疗方案成为目前最迫切的需要。
　　 本论文通过体外的方法观察佛波酯类化合物(12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯,12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA和12-O-乙酰佛波醇-13-癸酰酯,12-O-acetylphorbol-13-decanoate,APD)联合抗白血病药物(抗代谢类的阿糖胞苷,Cytarabine,Ara-c和细胞因子类的重组人粒细胞集落刺激因子,recombinanthuman granulocyte colony-stimulation factor,rhG-CSF)对K562细胞抑制增殖和诱导分化两方面的影响,初步探讨佛波酯类化合物对白血病细胞的作用机制,并为抗白血病新药的开发提供理论依据。同时,寻找新的能够提高慢性粒细胞白血病疗效的药物联合治疗方案,为白血病的治疗提供新的途径。
　　 研究方法
　　 1佛波酯类化合物联合Ara-c对K562细胞作用的影响
　　 1.1细胞培养用RPMI1640培养基在37℃,5％CO2饱和湿度的无菌培养箱中常规培养,每3天传代1次。
　　 1.2TPA、APD、Ara-c单用和合用的浓度效应关系测定及细胞形态学的观察MTT的方法检测药物单独及联合作用后细胞抑制率的变化,分别于各组培养24、48、72h后观察细胞形态学的变化。
　　 1.3TPA或APD联合Ara-c对细胞诱导分化作用的影响收集各组细胞,分成两份,一份加入0.1％NBT重悬孵育后,染色,镜下观察细胞分化阳性率。另一份加入抗人单克隆抗体CD15-FITC和抗人单克隆抗体CD14-PE避光孵育后,流式细胞仪检测。
　　 2 TPA联合rhG-CSF对K562细胞作用的影响
　　 2.1细胞培养用RPMI1640培养基在37℃,5％CO2饱和湿度的无菌培养箱中常规培养,每3天传代1次。
　　 2.2TPA联合rhG-CSF对K562细胞增殖的影响及细胞形态学的观察MTT的方法测定药物单用和联合作用后的抑制率,绘制量效曲线,并进行统计学分析。分别于各组培养24、48、72h后观察细胞形态学的变化。
　　 2.3 TPA联合rhG-CSF对K562细胞分化的影响 NBT还原试验和流式细胞仪检测细胞分化成熟比率。
　　 3统计分析结果采用SPSS10.0统计软件进行数据分析,所有数据均用(x)±S表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间均值比较。P<0.05记为有统计学差异。
　　 结果：
　　 1佛波酯类化合物联合Ara-c对K562细胞作用的影响
　　 1.1细胞形态学的影响 TPA作用72h后,细胞聚集、折光率降低、体积变大、向周围伸出伪足,一部分细胞呈贴壁状态生长。高倍观察发现胞内出现许多小气泡状物质,类似网球拍状。APD作用后,细胞形态变化与TPA类似。Ara-c作用72h后,表现为细胞体积变大、折光率降低、板底出现许多细胞碎片,高倍下观察到明显的细胞破裂溶解,并呈浓度依赖性,1.44μmol·L-1以上浓度少量细胞伸出伪足,呈贴壁状态生长。TPA或APD和Ara-c合用后,形态学变化均比单用组明显。
　　 1.2 TPA、APD、Ara-c单用的浓度效应关系测定TPA、APD、Ara-c单独作用K562细胞72h后,TPA的IC50为1.20nmol·L-1,APD的IC50为91.69nmol·L-1,Ara-c的IC50为1.18μmol·L-1,均在较低的浓度就能够对K562细胞产生较强的抑制增殖的作用。
　　 1.3 TPA或APD联合Ara-c对细胞增殖抑制作用的影响 TPA能够协同低浓度的Ara-c(0.36μmol·L-1、0.72μmol·L-1)对K562细胞的抑制增殖作用,差异有统计学意义(P<0.05),但对Ara-c1.44μmol·L-1和1.8μmol·L-1这两个浓度对细胞的作用没有影响。APD不能协同Ara-c对K562细胞增殖的抑制作用。
　　 1.4 TPA或APD联合Ara-c对细胞诱导分化作用的影响 TPA和APD单独作用后能够诱导K562细胞向单核巨噬方向分化；Ara=c不仅能够诱导细胞向单核巨噬方向分化,还同时诱导向粒系方向分化。TPA能够协同Ara-c0.36μmol·L-1对K562细胞向单核方向的诱导分化作用,差异有统计学意义(P<0.001),但对其使细胞向粒系方向分化的作用没有影响。对于相对高浓度的Ara-c(1.44μmol·L-1)的诱导分化作用也没有影响。APD不能协同Ara-c对K562细胞的诱导分化作用。
　　 2 TPA联合rhG-CSF对K562细胞作用的影响
　　 2.1细胞形态学的影响 rhG-CSF各浓度单独作用K562细胞后,细胞形态变化均不明显。
　　 2.2 TPA、rhG-CSF单用的浓度效应关系测定 rhG-CSF各浓度作用K562细胞72h后对细胞的增殖抑制作用不明显。
　　 2.3 TPA联合rhG-CSF对K562细胞增殖的影响 TPA联合rhG-CSF对K562细胞的增殖抑制没有协同作用。
　　 2.4 TPA联合rhG-CSF对K562细胞分化的影响 rhG-CSF作用后,能使K562细胞向粒系方向诱导分化,但作用较微弱。TPA联合rhG-CSF对K562细胞的诱导分化没有协同作用。
　　 结论：
　　 1 TPA、APD、Ara-c对K562细胞均有抑制增殖,诱导其向单核巨噬细胞方向分化的作用。
　　 2 TPA能够协同Ara-c对K562细胞的抑制增殖和诱导分化作用,APD却不能。
　　 3 rhG-CSF对K562细胞的增殖既无促进作用,也无抑制作用,可以诱导K562细胞向粒细胞方向分化,与TPA联合对K562细胞无协同作用。

目录

文摘

英文文摘

第1章 前言

第2章 佛波酯类联合Ara-c对K562细胞的影响

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果

2.5 讨论

2.6 结论

第3章 TPA联合rhG-CSF对K562细胞的影响

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果

3.5 讨论

3.6 结论

第4章 全文小结

参考文献

附图

综述

参考文献

个人简历

致谢