LI患者TGM 1基因序列分析及其指甲中TGase 1活性与内皮蛋白表达相关性分析

摘要

背景：
　　 人体表面的上皮细胞(Surface epithelial cells)如角质形成细胞(keratinocyte，KC)等，在经历了细胞分化演变后形成一个复层表皮结构。该复层表皮结构是机体抵御外界影响的十分坚固的物理、化学屏障。而实现该屏障功能最关键的结构成分是位于表皮最浅层的角质膜套（cornified cell envelope，CE）。角质膜套是一个坚固的蛋白质/类脂聚合体，形成于细胞膜下，而固定于已死亡的角质细胞(cornified cells)表面。它包含蛋白膜套（protein envelope）和脂质膜套(lipidenvelope)两个部分。在角质形成细胞终末分化阶段，内皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、富含脯氨酸小蛋白(small proline-rich protein)等结构蛋白的共价交联，对于角质膜套的形成具有十分重要的意义。这些交联反应需要转谷氨酰胺酶1（transglutaminase1，TGase1）的参与。转谷氨酰胺酶1是一个钙离子依赖性酶，可以催化蛋白分子间异肽键的形成。
　　 转谷氨酰胺酶1在角质形成细胞的终末分化阶段，开始表达并被激活，通过交联反应来促进角质膜套的生成。编码转谷氨酰胺酶1的基因(TGM1)已经被学者从人类基因组DNA中分离出来，并进行了描述。其含有14.3千碱基对，包含了15个外显子。转谷氨酰胺酶1是参与角质膜套的合成而被人们所认识的。在角质形成细胞分化进程中，转谷氨酰胺酶1被蛋白水解酶有限裂解而激活，进而参与到随后的底物交联中去。因此，转谷氨酰胺酶1活性的紊乱可以产生异常的皮肤表型。
　　 内皮蛋白是第一个被发现和克隆的前体物质，是角质膜套的一个重要的组成成分。其开始表达于角质形成细胞分化阶段早期，被认为是早期膜套的组成成分，为随后其它的前体物质的交联提供膜套支架。在体外，该交联优先选择Gln496位点。交联是一个有序的过程，Gln496是第一个交联位点，其他的交联位点随时间的往后推移而逐渐发挥作用。
　　 板层状鱼鳞病（Lamellarichthyosis，LI）是一种常染色体隐性遗传病，是一种严重的皮肤角化紊乱，表现为皮肤的泛发性过度角化。由于在表皮终末分化阶段，转谷氨酰胺酶1介导了细胞膜套交联的形成，所以TGM1突变造成的转谷氨酰胺酶1的功能缺陷被普遍认为是板层状鱼鳞病的病因。此外，在板层状鱼鳞病患者的异常角质膜套中，人们观察到了过度表达的内皮蛋白。因此，转谷氨酰胺酶1的功能异常可以改变内皮蛋白的交联和角质膜套的形成。但是，转谷氨酰胺酶1的活性和内皮蛋白的表达两者之间的联系仍然不清楚，亦未见有相关报道。
　　 本实验对板层状鱼鳞病患者TGM1基因的突变，板层状鱼鳞病患者和对照组的转谷氨酰胺酶1的活性、内皮蛋白的表达以及转谷氨酰胺酶1的活性和内皮蛋白的表达两者之间的相关性进行了探讨。材料和方法：
　　 1.收集8例板层状鱼鳞病患者(LI组)和8例志愿者（对照C组）指甲，并抽取2例板层状鱼鳞病血液标本。
　　 2.将抽取的2例板层状鱼鳞病血液标本送本元正阳基因公司进行TGM1基因序列分析。
　　 3.采用CellyticTM试剂提取指甲总蛋白。
　　 4.样品蛋白进行SDS-PAGE电泳，对电泳条带进行转膜，再采用免疫印迹法检测内皮蛋白。（图像分析）。
　　 5.采用斑点印迹法检测TGase1酶活性。（图像分析）。
　　 6.采用SPSS10.0统计分析软件进行两组间的方差分析和相关性分析。
　　 结果：
　　 1.患者TGM1基因序列分析：2例LI患者TGM1基因序列的第3、8、12及13外显子皆有错义的点突变，其中1例症状较重者还有第3外显子150T的缺失导致的提前终止。
　　 2.两组指甲总蛋白SDS-PAGE电泳结果比较：LI组指甲总蛋白SDS-PAGE电泳显示5条主带，即69kDa、63kDa、54kDa、48kDa、38kDa，C组显示后4条主带。LI组69kDa、63kDa的灰度均值(GSM)分别为131.98±1.35、154.36±1.46，C组63kDa的GSM为136.56±1.38，两组63kDa的GSM相比，P＜0.05。
　　 3.两组指甲内皮蛋白表达的GSM比较：LI组内皮蛋白表达于69kDa、63kDa主带，其GSM分别为139.92士1.44、148.54士1.6;C组内皮蛋白表达于63kDa主带，其GSM为135.96±1.10。两组63kDa内皮蛋白表达的GSM相比，P＜0.05。
　　 4.两组指甲TGase1酶活性的GSM比较：TGase1的GSM为122.49±1.32，C组为169.11±1.14，C组TGase1斑点印迹信号强于LI组，两组相比，P＜0.05。
　　 5.内皮蛋白表达与TGase1酶活性的相关性：C组63kDa内皮蛋白表达与TGase1酶的GSM呈正相关（r=0.762，P＜0.05），LI组63kDa、69kDa内皮蛋白与TGase1酶的GSM呈负相关（r分别为-0.780、-0.837，P均＜0.05）。
　　 结论：
　　 1.两例板层状鱼鳞病患者的TGM1基因序列分析，显示第8、12、及13外显子皆有错义的点突变，其中1例症状较重患者还有第3外显子150T的缺失导致的提前终止，提示LI组的TGase1的表达存在异常。
　　 2.LI组指甲总蛋白SDS-PAGE电泳显示5条主带，而C组显示4条主带，提示LI组的指甲总蛋白存在异常。
　　 3.LI组内皮蛋白表达于69kDa、63kDa主带，C组内皮蛋白定位于63kDa主带，提示LI组内皮蛋白可能过度表达。
　　 4.C组TGase1斑点印迹信号强于LI组，提示LI组的TGase1活性弱于对照组C组。
　　 5.C组63kDa内皮蛋白表达与TGase1酶活性的GSM呈正相关，LI组69kDa、63kDa内皮蛋白表达与TGase1酶活性的GSM呈负相关，提示LI组内皮蛋白的过度表达可能是对TGase1酶活性异常导致LI患者皮肤屏障功能缺陷的一种代偿性表达。

目录

文摘

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缩略词表

LI患者TGM1基因序列分析及其指甲中TGASE1活性与内皮蛋白表达相关性

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述 角质膜套的研究进展

参考文献

个人简历

致谢