罗红霉素诱导的LQTS：hERG钾通道阻断和蛋白运输障碍

摘要

研究背景和目的
　　 长QT综合征(10ng QT syndrome,LQTS)是指心电图上表现为QT间期延长、ST-T段异常,易产生恶性室性心律失常,如尖端扭转型室速的一组综合征。主要临床表现是发作性晕厥、心脏性猝死。根据发病因为的不同,可分为获得性和先天性LQTS。而获得性LOTS主要与药物有关,如抗心律失常药物、抗菌药等。因临床药物引起的LOTS时有报道,故这种现象已引起各国药品管理部门广泛而高度的重视。多种抗感染药物均有引起获得性LQTS的报道,其中相对较多的是大环内酯类抗生素。药物诱导的LQTS通常被认为是直接阻断了hERG编码的快速激活的延迟整流钾通道Ikr,使心肌复极过程延长,心电图上表现为QT间期延长。近年来,蛋白运输障碍已成为研究热点,即药物选择性的阻断hERG蛋白至细胞膜表面的运输,致使膜上成熟hERG蛋白减少。现已知,大环内酯类抗菌药可以直接抑制hERG钾通道,但其是否并存对hERG蛋白运输的慢性抑制,目前尚未见报道,且其与hERG钾通道的结合位点也不甚清楚。因此,本课题探讨了以罗红霉素为代表药引起的LOTS是否和hERG蛋白运输障碍有关以及其抑制hERG钾通道的作用位点,为该类抗菌药物的合理应用提供理论依据。
　　 材料与方法
　　 1.药物
　　 罗红霉素由扬子江药业集团有限公司提供(纯度99.8％),溶于二甲基亚砜(DMSO)中配置成10 mM的母液。需要时用正常台氏液或DMEM培养基进行稀释配成不同浓度的罗红霉素。DMSO的终浓度小于0.1％,对bERG电流的记录无显著影响。
　　 2.HEK-293细胞培养和转染
　　 人胚肾上皮细胞HEK-293在含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的高糖DMEM培养液中培养,放置于37℃,2,5％CO2的细胞培养箱中培养并传代。待细胞长到70-80％密度左右时,用胰酶消化传代,根据所用的转染方法以相应密度于培养皿中继续培养。参照Lipofectamine TM2000试剂盒说明书或用磷酸钙转染法,分别转染以下各种质粒:①野生型pcgi-WT-hERG②突变型pcgi-Y652A-hERG和pcgi-F656C-hERG。
　　 3.全细胞膜片钳技术记录hERG钾通道电流
　　 寻找表达有绿色荧光的单个HEK-293细胞,采用全细胞膜片钳技术,选用不同的实验方案,分别记录罗红霉素对野生型WT、突变型Y652A和F656C钾通道电流和其动力学特征的变化。
　　 4.Western blotting检测hERG蛋白的表达
　　 酶解收集蛋白,BCA法测蛋白含量,RIPA裂解蛋白,9％的SDS-PAGE凝胶电泳,PVDF转膜,5％脱脂牛奶室温封闭,抗hERG抗体(1:200),4℃孵育过夜,HRP标记的二抗(1:10000),室温孵育1 h,ECL显色。通过Quantity
　　 one软件分析每条带的灰密度值,与自身内参β-actin条带的灰密度相比,对每条带进行半定量分析。
　　 5.激光共聚焦技术
　　 将转染有bERG钾通道的HEK293细胞进行激光共聚焦定位,FITC(绿色)用波长488 nm的氩离子激光激发。
　　 6.统计学处理
　　 所有数据用Mean±S.E.M表示,SPSS17.0软件作统计学分析,用Origin6.0软件制图。统计比较采用单因素方差分析和配对t检验。P<0.05为差异有显著性。
　　 结果：
　　 1.罗红霉素直接抑制野生型WT-hERG钾电流(IKr)
　　 分别用0.1、1、3、10、30、100和300/μM的罗红霉素作用于转染有hERG基因的HEK293细胞,记录hERG电流的变化。罗红霉素呈浓度依赖性的抑制野生型WT-hERG电流,抑制率依次为-(3.4±3.4)％、(0.3±3.9)％、(4.0±3.7)％、(20-3±3.4)％、(32.9±4.2)％、(70.9±5.2)％和(75.9±3.0)％。罗红霉素对WT-hERG的IC50值为55.8±9.1μM,Hill系数为0.9±0.1。罗红霉素对WT-hERG的激活曲线影响的结果显示:加药前的半数激活电压(V1/2)为-2.8±0.2 mV,激活斜率(k)为10.3±0.2 mV,而加入10μM的罗红霉素之后的V1/2为-4.0±o.5 mV,k为11.1±0.4 mV,经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。罗红霉素对WT-hERG的失活曲线影响的结果显示:加药前的hERG钾通道的半数失活电压(V1/2)为-45.0±1.0 mV,失活斜率(k)为24.5±1.0 mV,而加入10μM的罗红霉素之后的V1/2为-42.5±0.9 mV,k为23.1±0.9 mV,经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。罗红霉素对bERG钾通道的激活和失活曲线均无影响。由罗红霉素对突变体Y652A-hERG和F656C-hERG钾通道的作用可以看到,100μM的罗红霉素对WT-hERG钾通道的抑制率为(70.9±5.2)％,而对Y652A-hERG钾通道的抑制率为(1.9±2.7)％,其抑制Y652A-hERG钾通道电流的IC50值为4622.9±1872.7μM,Hill系数为0.8±0.2,其IC50值约是罗红霉素抑制WT-hERG钾通道IC50值的83倍。Y652A的突变显著削弱了罗红霉素抑制WT-hERG钾通道的能力。同样,当罗红霉素的浓度为100、300和1000μM时,其对WT-hERG钾通道分别抑制了(49.9±11.9)％、(63.7±7.4)％和(70.9±7.5)％；而对F656C-bERG钾通道分别抑制了(12.8±4.3)％、(23.5±5.8)％和(30.1±6.4)％。F656C的突变同样显著削弱了罗红霉素抑制WT-hERG钾通道的能力。
　　 2.罗红霉素对hERG蛋白运输的影响
　　 用1、10和100μM的罗红霉素分别作用于转染有hERG钾通道的HEK293细胞,36～48 h后提蛋白进行Western blotting检测。结果显示:hERG钾通道蛋白在未加药物的HEK293细胞的表达存在两条带,分子质量分别约为155 kDa(成熟蛋白)和135 kDa(未成熟蛋白)。与对照组相比,155 kDa条带的密度随着罗红霉素浓度的增加而减少,而135 kDa条带的密度基本没有变化,罗红霉素呈浓度依赖性的抑制hERG钾通道蛋白的表达,经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。
　　 为了同时验证生化结果,该实验又观察了不同浓度的罗红霉素处理HEK293细胞36～48 h后对hERG钾电流的影响。结果显示:罗红霉素呈浓度依赖性的抑制hERG通道的尾电流密度。结果表明细胞膜表面的功能性通道数量和hERG蛋白的运输缺陷密切相关。
　　 3.共聚焦技术对hERG蛋白的细胞定位
　　 利用共聚焦显微镜观察到,野生型hERG钾通道蛋白主要定位在细胞膜上。罗红霉素处理后细胞膜上的荧光强度较处理前明显减弱,荧光主要弥散于细胞浆中,与Western blotting的结果一致。
　　 结论：
　　 罗红霉素致LQTS的机制与其直接阻断hERG钾通道和间接抑制hERG蛋白向细胞膜的运输有关。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

1 材料

1.1 质粒

1.2 药品及试剂

1.3 主要溶液配制

1.4 主要实验仪器

2 方法

2.1.cgi-hERG质粒的提取

2.2 PCR定点突变

2.3 细胞培养

2.4 转染

2.5 微电极的制备

2.6 bERG电流的记录和测量

2.7 Western blotting法测hERG蛋白

2.8 共聚焦技术对bERG蛋白的定位

2.9 统计学处理

结果

1 罗红霉素直接抑制野生型WT-hERG钾电流(IKr)

2 罗红霉素对hERG钾通道动力学的影响

2.1 罗红霉素对WT-hERG钾通道激活曲线的影响

2.2 罗红霉素对WT-hERG钾通道的稳态失活过程的影响

3 罗红霉素对突变体Y652A-hERG和F656C-hERG钾通道的作用

4 罗红霉素对hERG蛋白运输的影响

5 共聚焦技术对hERG蛋白的定位

讨论

结论

参考文献

综述

1 前言

2 细胞内hERG蛋白运输的分子机制

2.1 糖基化

2.2 内质网保留信号

2.3 细胞质中分子伴侣

2.4 高尔基体

3 蛋白运输障碍机制

3.1 内质网中缺陷hERG蛋白的保留

3.2 蛋白运输障碍引起的阴离子支配的抑制作用

3.3 hERG和GM130交互作用的中止

3.4 抑制细胞质分子伴侣Hsp90导致的运输障碍

4 恢复hERG的正常运输

4.1 温度效应

4.2 转录调整器

4.3 非特异的化学分子伴侣

4.4 特异的药理学分子伴侣

5 结论

参考文献

个人简历

在读期间参加学术会议情况

在读期间发表的学术论文

致谢