氯化汞对大鼠原代睾丸间质细胞类固醇激素合成的影响

摘要

危害生殖健康的环境污染物种类较多，重金属是其中之一。汞可以对神经系统、血液系统、消化系统及生殖系统等造成损伤。汞可以在睾丸组织蓄积而影响精子的质量、数量及精子的产生，诱发男性不育症。
　　 目的
　　 该研究利用成年大鼠睾丸间质细胞(Leydig cell)作为模型，通过观察氯化汞对睾丸间质细胞类同醇激素合成的影响，以进一步探讨无机汞对雄性生殖系统的毒作用机制。
　　 方法：
　　 1.睾丸间质细胞的提取、纯化及鉴定
　　 2.Leydig细胞贴壁时间的选择：睾丸间质细胞分别培养2 h、3 h、6 h、12 h、24 h后，收集尚未贴壁的悬浮细胞和培养液转移到新的培养瓶内，加含血清的DMEM/F12培养液继续培养；原培养瓶内的细胞改加无血清培养液继续培养。显微镜下分别观察细胞数目和形态，确定最佳贴壁时间。
　　 3.HgCl2对Leydig细胞活性的影响：分别加入含不同浓度HgCl2培养液染毒细胞，采用MTT法，确定染毒剂量。
　　 4.Leydig细胞培养上清中孕酮含量的测定：睾丸间质细胞做如下操作：①加入人绒毛膜促性腺激素(HCG)终浓度分别为0.0IU/ml、0.1IU/ml、1.01IU/ml、10.0IU/ml和100.0IU/ml培养液培养4 h后，提取培养上清液，采用放射免疫分析法(RIA)测定孕酮含量；②用10-6mol/L HgCl2和10.0 IU/ml HCG混合染毒细胞，加入10.0 IU/ml HCG的作为对照，分别在1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h提取培养上清液，RIA测定孕酮含量；③分别加入含10IU/ml HCG的HgCl2浓度为0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的无血清培养基，染毒3 h后，RIA测定上清中孕酮的含量。
　　 5.Leydig细胞中StAR、P450scc和3β-HSD mRNA表达水平：分别加入HgCl2终浓度为10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的无血清培养基，0mol/L剂量组为对照组，染毒3 h后，提取RNA，运用实时定量PCR技术检测HgCl2对Leydig细胞中StAR、P450scc和3β-HSD mRNA表达的影响。
　　 结果：
　　 1.鉴定结果：Leydig细胞活率在90％以上，纯度约为97％，均达到试验要求。
　　 2.Leydig细胞贴壁时间的选择和确定：6 h，12 h和24 h组原培养瓶内的细胞数量一致，12 h和24 h原培养瓶内细胞形态一致且较6 h组形态相对混杂，所以确定6 h为最佳贴壁时间。
　　 3.MTT结果：10-4mol/L HgCl2抑制细胞的活性(P<0.05)；其他剂量组和对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 4.RIA结果：①在HCG刺激下，睾丸Leydig细胞分离孕酮的量HCG浓度为10IU/ml时最高。因此，选择10IU/ml作为HCG的刺激浓度；②染毒组和对照组的Leydig细胞分泌孕酮的量均在6 h到达峰值，且在各时间点混合组的孕酮量均低于对照组，但仅在3 h和12 h两个时间点，两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。因为在睾酮生成的过程中，孕酮可以在细胞色素P45017α-羟化酶(P450c17)作用下转变为其他类固醇激素，故选择染毒时间为3 h。③Leydig细胞经不同浓度HgCl2染毒后，Leydig细胞分泌孕酮的量均有所降低，其中10-7mol/L和10-6mol/L HgCl2染毒组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 5.实时定量PCR结果：10-8mol/L HgCl2剂量组StAR、P450scc和3β-HSDmRNA相对表达量均与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；而10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L HgCl2剂量组的StAR、P450scc和3β-HSD mRNA相对表达量均明显低于对照组(P<0.05)。
　　 结论：
　　 在该实验条件下，HgCl2对原代培养的大鼠睾丸Leydig细胞在10-8mol/L～10-5mol/L剂量范围对细胞活力没有明显影响，而10-4 mol/L以上剂量的HgCl2对Leydig细胞活性有明显的抑制作用。10-8mol/L～10-5mol/L剂量范围的HgCl2作用于原代培养的大鼠Leydig细胞，StAR、P450scc和3β-HSD基因的mRNA的相对表达量均有所降低，其中10-7～10-5mol/L剂量组和对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

目录

文摘

英文文摘

图和附表清单

缩略词

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 Leydig细胞鉴定

3.2 差速贴壁时间的选择和确定

3.3 Leydig细胞生长曲线

3.4 HgCl2对Leydig细胞活性的影响

3.5 HgCl2对Leydig细胞分泌孕酮能力的影响

3.6 HgCl2对Leydig细胞StAR、P450scc和3β-HSD mRNA水半的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

环境雌激素的研究进展

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文及科研成果

致谢