巴戟天糖链促血管生成及血管内皮细胞迁移的实验研究

摘要

研究背景和目的:
　　 近年来,缺血性心脏病发病率逐年上升,全世界发病率为2％。心肌梗死(myocardial infarction,MI)是目前严重危害人类健康的疾病之一,而慢性心功能衰竭(chronic heart failure,CHF)是MI致死的主要原因之一。分子搭桥术(molecular bypass,又名治疗性血管新生therapeutic angiogensis)为缺血性损伤的心肌细胞及衰竭的心肌细胞功能恢复提供了一种全新的治疗策略。分子搭桥术,即通过一些方法的刺激包括某些药物的治疗作用在病损心肌区域增加功能性(治疗性)的冠状动脉分支或侧支,以达到恢复缺血心肌血供,改善患者症状和预后的目的。近十年的研究结果证实,分子搭桥能帮助机体建立有效的侧支循环,从根本上缓解心肌缺血症状,改善病情,从而分子搭桥已经成为目前世界心血管医学领域的热点课题。因此,深入研究分子搭桥的内在机制以及开发有效的促进分子搭桥药物,必将极大的提高缺血性心脏病人的生活质量和寿命长度。本导师组近年来一直致力于巴戟天糖链(Morinda officinalisoligosaccharides,MOO)保护心脏作用的研究,前期的研究已证实:MOO具有明显的减轻缺氧复氧或缺血再灌注对心肌细胞的损伤；可以促进鸡胚绒毛尿囊及大鼠缺血心肌中血管的生成；增加其微血管(MVD)的数量及密度；显著上调与血管新生相关的VEGF、bFGF蛋白的表达；血管生成基因芯片结果显示MOO可显著上调多种促血管生成基因mRNA的表达,下调多种抑制血管生成基因mRNA的表达；MOO可剂量依赖性的提高血管细胞中TRPC6蛋白的表达。因此,本实验以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,采用血管内皮迁移和小管生成实验观察MOO对缺氧复氧损伤内皮细胞迁移及管腔样结构的形成的影响,采用流式细胞仪技术观察缺氧复氧损伤后各组细胞的增殖情况,旨在进一步观察MOO促血管生成效应,并为其在缺血心肌保护及促进缺血心脏建立侧枝循环方面的作用提供更加直观的实验依据。
　　 1 HUVEC细胞的培养
　　 HUVEC细胞接种到50ml培养瓶培养,加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基,在37℃,5％CO2,饱和湿度培养箱中培养1～2 d,细胞逐渐长成单层融合状。倒置显微镜下观察细胞核圆,核膜清晰,细胞呈梭形多边状,表现为典型铺路石样。当培养瓶长满80％左右即可用胰蛋白酶消化传代或冻存。
　　 2细胞模型的制作与确定
　　 种板培养24h后,各孔弃去培养基,用无糖Earle's液洗细胞2次,正常对照组加入1640培养基；模型组加入含连二亚硫酸钠终浓度为1mM的无糖Earle's液,造成细胞缺氧复氧损伤,阳性药对照组加入麝香保心丸(2 g·L-1),MOO各组加入含连二亚硫酸钠终浓度为1mM的无糖Earle's液及MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1),37℃孵育4h；取出培养板,吸弃各实验孔液体,用无糖Earle's液洗细胞2次,各实验孔均换含药的无血清1640培养基,继续培养12h,造成细胞复氧损伤。
　　 3实验分组
　　 本实验分为六组:
　　 ①正常细胞组
　　 ②缺氧复氧损伤模型组
　　 ③缺氧复氧损伤模型+阳性对照药麝香保心丸组(2g／L)
　　 ④缺氧复氧损伤模型+小剂量MOO组(0.05g／L)
　　 ⑤缺氧复氧损伤模型+中剂量MOO组(0.15g／L)
　　 ⑥缺氧复氧损伤模型+大剂量MOO组(0.45g／L)
　　 4观察指标
　　 正常培养HUVEC细胞3～8代,制作缺氧复氧损伤模型,给予不同剂量MOO干预12h,①倒置显微镜观察其生长状态；②流式细胞仪检测各实验组细胞生长状况；③观察在缺氧复氧条件下各组人脐静脉内皮细胞的迁移状况；④观察在缺氧复氧条件下各组人脐静脉内皮细胞的小管形成状况。
　　 5统计学处理
　　 统计学处理用SPSS16.0。计量资料数据用均数±标准差((x)±s)表示。检验结果均取a=0.05作为检验水准。组间比较采用单因素方差分析,当差异有显著意义时进一步用q检验进行两两比较。
　　 结果:
　　 1损伤4h后,镜下可见模型组细胞收缩变圆,细胞形态不规则,间隙明显变大,并有部分脱落。
　　 2流式细胞仪检测结果显示:与正常组相比,缺氧复氧模型组增加了G2+S期的细胞,与模型组相比,MOO大、中剂量减弱了这种趋势,使细胞状态更接近于正常细胞,小剂量的MOO的作用不明显。
　　 3与缺氧复氧损伤模型组对比,巴戟天糖链各剂量组细胞迁移数量显著增多,并呈剂量依赖性的促进小管形成。
　　 结论:
　　 1 MOO可显著减轻缺氧复氧对HUVEC的损伤,抑制细胞凋亡,有效保护血管内皮细胞。
　　 2 MOO显著促进血管内皮细胞迁移和小管的形成,提示是其促进治疗性血管生成的重要基础之一。