抗肾小球基底膜抗体的中和性单链抗体的筛选、表达、鉴定与应用

摘要

抗肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)病指的是循环中抗GBM抗体在脏器中沉积所引起的一组自身免疫性疾病。其特点是在外周血中可检测到抗GBM抗体，或肾活检病理在肾小球基底膜上见到抗GBM抗体呈线样的沉积。抗GBM抗体是公认的致病性抗体，它的靶抗原也称为Goodpasture(GP)抗原，即基底膜Ⅳ型胶原α3链的非胶原区1[α3(Ⅳ)NC1]。在正常情况下，该抗原隐蔽在基底膜Ⅳ型胶原的非胶原区中。在环境因素或其它因素的作用下，一旦该抗原决定簇暴露，即可诱发自身免疫反应。抗GBM病大多病情凶险，起病急、进展快，是预后最差的肾脏病之一。尽管目前临床上采用血浆置换与糖皮质激素联合环磷酰胺进行治疗，仍有少数患者早期死于肺大出血。尤其是血浆置换疗法仅能清除循环中游离的抗GBM抗体，而不能彻底清除已经与GBM结合的抗体，不仅费用昂贵，还有可能增加血液传播疾病的风险。而联合应用大剂量糖皮质激素和环磷酰胺进行冲击治疗，倒是可以抑制疾病早期免疫炎症反应，但是这种疗法同时也抑制了全身的免疫防御反应，会加重或诱发感染。因此，如何能够特异性的抑制抗GBM病的免疫反应将成为富有前景的课题。
　　 噬菌体展示技术是目前一项极其重要的抗体工程技术，它可以直接从抗体库中筛选出特异性噬菌体抗体，并将抗体片段呈现于噬菌体的表面。噬菌体抗体兼备了多克隆抗体和单克隆抗体的很多性能，而且可以经过很容易的改建，在大肠杆菌或酵母菌中进行大规模的生产。因此，噬菌体抗体在疾病的诊断与治疗中表现出非常巨大的潜能和广阔的应用前景。
　　 本研究即运用新型的噬菌体展示技术，拟从噬菌体抗体库中筛选出抗GBM抗体的中和性单链抗体基因，然后利用基因工程重组技术，将筛选出来的单链抗体基因进行克隆及表达载体的构建，最后通过诱导和亲和层析技术获得了纯化的抗GBM抗体的中和性单链抗体蛋白，并在体内外验证单链抗体蛋白是否可与抗GBM抗体进行特异性的结合，从而阻滞或减轻抗GBM抗体与靶抗原结合所产生的脏器损害，希望能为抗GBM病提供更多的治疗手段和实验依据。
　　 方法：
　　 1.纯化抗GBM病患者血清中的抗GBM抗体，采用噬菌体表面展示技术，获得一个与人抗GBM抗体结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆，并对该克隆序列进行DNA序列测定分析。
　　 2.用PCR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因，将scFv3 DNA与pGEM-T Easy质粒连接，构建克隆载体pGEM-scFv3。用酶切电泳验证重组表达结果正确；测序检测质粒重组后序列有无改变。再将scFv3亚克隆入表达载体pQE-80L，构建pQE80L-scFv3重组质粒，转化大肠杆菌Rosetta2菌，通过酶切进行鉴定。IPTG诱导表达蛋白后，通过SDS-PAGE、Western blot和竞争抑制法对表达产物进行检测。
　　 3.将Wistar大鼠随机分为五组：(1)肾炎模型组：经尾静脉注入患者抗GBM抗体(1.5mL/100g)。(2)对照Ⅰ组：经尾静脉注入0.4g/L的正常人IgG(1.5mL/100g)。(3)对照Ⅱ组：经尾静脉注入抗GBM抗体的中和性单克隆抗体(1.5mL/100g)。(4)干预Ⅰ组：经尾静脉注入人抗GBM抗体(1.5mL/100g)，第7天后再经尾静脉注入抗GBM抗体的中和性单克隆抗体(1.5mL/100g)。(5)干预Ⅱ组：经尾静脉注入人抗GBM抗体(1.5mL/100g)，第14天后再经尾静脉注入抗GBM抗体的中和性单克隆抗体(1.5mL/100g)。分别在第7天、第14天、第21天观察大鼠的24尿蛋白定量，尿素氮，肌酐，肾组织病理学的变化。计量资料均以x±s表示。组间差异比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用t检验，以a=0.05为检验水准。统计学分析采用SPSS13.0软件进行处理。
　　 结果：
　　 1.对噬菌体单链可变区抗体库经过3轮的筛选后，与第1轮相比富集了137倍。检测噬菌体抗体与人抗GBM抗体的结合活性，其中有35株克隆ELISA的吸光度较高。对这些噬菌体抗体进行变叉反应后，确定其中有10株交叉反应较弱。确定1株(C31)阳性克隆提取质粒，进行DNA序列测定，DNA大小为750bp，并符合人源化单链可变区抗体的序列结构。
　　 2.PCR扩增scFv3 DNA片段约为750bp，与预期结果相同；克隆载体pGEM-scFv3酶切后显示scFv3成功的克隆入pGEM-T Easy质粒；测序验证插入片段全序列无改变；表达载体pQE80L-scFv3酶切图谱与预期相同；SDS-PAGE显示，在分子量约为27kD处可见目的蛋白带，Western blot和竞争抑制实验证实scFv3能与抗GBM抗体特异性结合。
　　 3.第21天干预Ⅰ组24小时蛋白尿定量为(16.62±5.53)g/d、BUN为(11.53±2.26)mmol/L、Scr(102.46±16.86)μ mol/L，均显著低于肾炎模型组(P<0.05)，干预Ⅱ组较肾炎模型组也有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。干预Ⅰ组和干预Ⅱ组较肾炎模型组肾脏细胞增生、新月体的形成及免疫复合物的沉积均减少，但干预Ⅰ组减少更为明显(P<0.05)。对照Ⅰ组和对照Ⅱ组之间无明显差异(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1.应用噬菌体展示技术成功获得人抗-抗GBM抗体的单链可变区抗体基因。
　　 2.成功构建并表达了抗GBM抗体的中和性单链抗体蛋白，并验证与人抗GBM抗体能特异性结合。
　　 3.早期应用抗GBM抗体的中和性单链抗体能够有效改善抗GBM肾炎大鼠的肾脏病变。