人参皂苷Rb1动员骨髓内皮祖细胞防治兔自体静脉移植物再狭窄的实验研究

摘要

第一部分人参皂苷Rb1动员自体静脉移植兔骨髓内皮祖细胞增殖的实验研究
　　 背景与目的:内皮祖细胞(EPCs)是内皮细胞的前体细胞，是一群具有游走功能并能增殖分化的幼稚细胞，不仅可以迁移至外周血中分化为成熟内皮细胞，参与胚胎时期的血管生成、出生后的新生血管的生长，还可以在一定条件下转化为平滑肌细胞，并且能够归巢在内皮细胞受损部位，分化为内皮细胞，参与受损内皮细胞的修复，为静脉血管桥的再狭窄的预防提供了新的思路。内皮祖细胞来源广泛，且具有易于分离、增殖能力强等多方面的特点，已成为血管组织工程中一种重要的种子细胞。正常情况下成熟血管内皮细胞与内皮的损伤以及内皮祖细胞对血管内皮的修复处于一种动态的平衡之中。病理状态下，机体储备的内皮祖细胞增殖并释放入外周血，并向内皮损伤部位定向迁移、粘附，协助修复损伤的血管内皮细胞，有效的减轻静脉桥血管的再狭窄。静脉移植术后的再狭窄，末期主要是粥样硬化，而血管内皮损伤是其始动因素，内皮细胞损伤后，巨噬细胞粘附、浸入及平滑肌细胞过度增殖导致受损血管管腔狭窄或者闭塞。促进损伤血管的内皮修复可有效抑制平滑肌细胞增殖及新生内膜的形成，为治疗静脉移植血管的再狭窄提供了一个新的方向。
　　 以往的研究发现人参皂苷Rb1能够促进内皮细胞培养基中的内皮祖细胞的增生，但未见有关于其对骨髓中内皮祖细胞影响的报道，实验通过在建立动物血管移植模型的基础上，观察动物股骨骨髓中内皮祖细胞表面标志CD34+、CD133+和VEGFR2+的阳性表达情况，探讨人参皂苷Rb1对自体静脉移植兔骨髓内皮祖细胞增殖的影响。
　　 材料与方法:45只清洁级新西兰兔随机分为实验组、模型组、对照组3组，每组15只。应用“no-touch”技术获取颈外静脉后，剪断颈总动脉，采用连续缝合方法端端吻合颈外静脉一颈总动脉，建立颈外静脉和颈总动脉移植的动物模型。4周后，取移植静脉血管，利用HE染色观察静脉移植血管内膜厚度以及内膜/中膜厚度比，免疫组化观察骨髓内CD34+、CD133+和VEGFR2+阳性细胞情况，RT-PCR检测骨髓内CD34+、CD133+和VEGFR2*阳性mRNA表达情况。
　　 结果:
　　 1、移植静脉桥血管狭窄程度观察
　　 石蜡切片HE染色光镜下观察分析结果显示：移植4周后的实验组、模型组、对照组血管的内膜厚度分别为(46.53±2.50)μm、(50.80±2.68)μm、(43.73±3.24)μm，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。3组静脉内膜/中膜厚度比分别为(1.96±0.06)、(2.11±0.07)、(1.81±0.09)，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。
　　 2、骨髓免疫组化
　　 CD34+、CD133+和VEGFR2+阳性细胞观察各组移植静脉血管中可见CD34+、CD133+和VEGFR2+阳性细胞表达.4周后，实验组阳性细胞表达高于模型组，模型组阳性细胞表达高于对照组，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。
　　 3、骨髓RT-PCRCD34+、CD133+和VEGFR2+基因表达情况观察
　　 各组移植静脉血管中可见CD34+、CD133+和VEGFR2+mRNA表达，CD34+在实验组、模型组、对照组表达的相对系数分别是(2.32±0.08)、(2.08±0.12)、(1.88±0.11)，各组间比较P<0.05，实验组、模型组.对照组组间比较有统计学意义；CD133+在实验组、模型组、对照组表达的相对系数分别是(2.46±0.12).(2.24±0.09).(1.97±0.15)，各组间比较P<0.05，实验组、模型组，对照组组间比较有统计学意义；VEGFR2+在实验组、模型组.对照组表达的相对系数分别是(1.92±0.14)，(1.79±0.15).(1.55±0.09)，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。
　　 结论:
　　 1.自体静脉移植兔骨髓CD34+、CD133+和VEGFR2+表达增强；
　　 2.人参皂苷Rb1能够促进骨髓内皮祖细胞的增生。
　　 第二部分人参皂苷Rb1抑制兔自体静脉移植物再狭窄的实验研究
　　 背景与目的:冠状动脉旁路移植术(CABG)是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要方法之一，大隐静脉作为冠脉旁路移植术的主要材料，由于位置表浅，取材方便，并且有足够的长度连接主动脉与远端的冠状动脉，使其在临床上得以广泛应用。但是手术操作造成的血管内膜损伤、血流动力学改变以及炎症因子释放等一系列变化引起静脉桥血管术后再狭窄，使得静脉桥血管在临床上的应用中发现远期效果欠佳。近年来，一系列预防静脉移植血管再狭窄的方法，如药物治疗、基因治疗、血管外支架、扩张液、内皮祖细胞等应用于临床，但是均未取得明确效果。有报道称：人参皂苷Rb1对抑制静脉桥血管再狭窄有一定的积极作用。实验即是在建立自体静脉移植血管动物模型的基础上，通过腹腔注射一定剂量的人参皂苷Rb1成品，观察静脉移植血管内膜厚度的变化以及血管内膜中增殖细胞核抗原(PCNA)、转化生长因子(TGF-β)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的变化，探讨人参皂苷Rb1对自体静脉移植血管再狭窄的抑制作用，为以后的临床应用提供理论依据。
　　 材料与方法:45只清洁级新西兰兔随机分为实验组、模型组、对照组3组，每组15只。应用“no-touch”技术获取颈外静脉后，剪断颈总动脉，采用连续缝合方法端端吻合颈外静脉和颈总动脉，建立颈外静脉一颈总动脉搭桥的动物模型。4周后，取静脉移植血管，利用HE染色观察静脉移植血管内膜厚度以及内膜/中膜厚度比，免疫组化观察静脉移植血管增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞指数、TGF-β、eNOS变化情况，RT-PCR检测静脉移植血管中TGF-β、eNOS mRNA基因的表达。
　　 结果:
　　 1、移植静脉桥血管狭窄程度观察：石蜡切片HE染色光镜下观察分析结果显示：移植4周后的实验组、模型组、对照组血管的内膜厚度分别为(46.53±2.50)μm、(50.80±2.68)μm、(43.73±3.24)μm，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。三组静脉内膜/中膜厚度比分别为(1.96±0.06)、(2.11±0.07)、(1.81±0.09)，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。
　　 2、移植静脉桥血管免疫组化染色结果观察：各组移植静脉血管中可见PCNA、eNOS、TGF-β阳性细胞表达。移植4周后的实验组、模型组、对照组PCNA阳性表达指数分别是(40.63±2.30)、(60.45±3.38)、(19.89±2.56)，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。实验组、模型组、对照组TGF-β阳性表达指数分别是(18.15±4.31)、(29.28±6.37)、(12.63±3.72)，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。实验组、模型组、对照组eNOS阳性表达指数分别是(25.64±5.03)、(17.91±3.75)、(10.25±2.31)，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。
　　 3、移植静脉桥血管RT-PCR结果观察：各组移植静脉血管可见eNOS、TGF-β基因表达。eNOS在实验组、模型组、对照组表达的相对系数分别为(2.12±0.05)、(1.98±0.09)、(1.72±0.09)，eNOS在实验组中表达的相对系数高于模型组和对照组，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。TGF-β在实验组、模型组、对照组表达的相对系数分别为(1.95±0.08)、(2.10±0.01)、(1.82±0.01)，TGF-β在模型组中表达的相对系数高于实验组和对照组，各组间比较P<0.05，实验组、模型组、对照组组间比较有统计学意义。
　　 结论：
　　 1、内膜损伤是移植静脉血管再狭窄的始动因素，血管壁重塑是静脉血管产生再狭窄的根本原因。
　　 2、人参皂苷Rb1能够有效的防治移植静脉血管再狭窄。
　　 3、人参皂苷Rb1能够促进移植血管NOS的基因表达、抑制TGF-β基因表达。