提高NK细胞对骨髓瘤细胞RPMI 8226杀伤活性的体外研究

摘要

研究背景:多发性骨髓瘤(MM)是恶性浆细胞克隆性增生的一种血液系统肿瘤,占所有癌症的1％,血液系统肿瘤的10％。现代的诱导治疗方案、造血干细胞移植、沙利度胺及新型蛋白酶体抑制剂的应用,MM的疗效得到不断提高。但大部分患者仍会复发或发生耐药。微小残留病(MRD)是提高治愈率和生存的主要障碍,也是耐药和复发的根源,MM仍然是一种难以治愈的疾病。因此,临床上迫切需要寻找更有效的治疗MM的方法。目前,针对MM的生物免疫治疗是最近十余年的重点研究领域,希望化疗的同时联合生物免疫治疗能彻底地控制并清除MRD,从而达到治愈MM的目的。
　　 生物免疫治疗是一种新兴的具有广泛应用前景的肿瘤治疗新模式。研究表明,在肿瘤的生物免疫治疗中,淋巴细胞发挥着重要作用。作为淋巴细胞中的一种,NK细胞一直是研究的热点。NK细胞是存在于骨髓和外周血等组织器官中的一类淋巴细胞,可以杀伤破坏肿瘤细胞和病原菌感染的细胞,对宿主正常的自身组织细胞并无细胞毒效应。NK细胞表面表达有多种受体(NKRs),根据其功能可分为抑制性受体和活化性受体。抑制性受体和活化性受体分别与靶细胞上相应的配体结合能抑制或激活NK细胞的杀伤功能。目前,已经发现的活化性受体主要有NKG2D受体和自然细胞毒受体(NCRs)两种。NCRs包括NKp46、NKp44、NNKp303种亚型。
　　 有研究表明,同种异体反应性自然杀伤(Allo-NK)细胞能杀伤原代的恶性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肠癌等恶性肿瘤细胞。但是,Allo-NK细胞对MM细胞的杀伤活性较低。
　　 目的:本实验通过对人骨髓瘤细胞RPMI8226生物学行为和NK细胞功能的研究,探讨:①细胞因子能否提高NK细胞对RPMI8226细胞的细胞毒效应；②其相关的分子机制是什么。从而为MM的治疗寻找新的方法,为生物免疫治疗治疗MM提供理论依据。
　　 方法:
　　 1.人骨髓瘤细胞RPMI8226的生物学特性观察光镜下RPMI8226细胞的形态和生长特点；流式细胞仪分析RPMI8226细胞的细胞周期；MTT法分析其耐药谱。
　　 2.NK细胞的收集与培养新鲜分离的人外周血单核细胞(PBMC),PBS清洗后分为A-F组,A组为对照组,B-F组每组分别加入细胞因子IL-2；IL-7；IL-21；IL-2+IL-7；IL-2+IL-7+IL-21刺激培养。
　　 3.NK细胞数量和表面受体的测定收集培养5d后的A-F组细胞,流式细胞术分析各组NK细胞的比例和NK细胞表面激活性受体(NKG2D、NK.p44、NNKp30)的表达量；实时定量PCR法分析各组NK细胞NKG2D和NKp46基因的表达情况。
　　 4.NK细胞对RPMI8226细胞的杀伤实验用CFSE／PI双染法检测培养5d后的A-F组NK细胞对人骨髓瘤细胞RPMI8226的细胞毒效应。
　　 结果:
　　 1.人骨髓瘤RPMI8226细胞呈圆形,体积较大,单个或球状悬浮生长,细胞群体倍增时间为37.11h。细胞周期为:G0／G1期细胞占26.5％,S期细胞占57.6％、G2／M期细胞占16.0％。不同浓度的不同药物对RPMI8226细胞的抑制作用呈浓度依赖性。
　　 2.流式细胞术显示:A组(对照组)与B组(IL-2)、C组(IL-7)、D组(IL-21)、E组(IL-2+IL-7)和F组(IL-2+IL-7+IL-21)组NK细胞比例分别为(7.23±1.86)％、(13.474±1.68)％、(5.334±0.97)％、(11.47±0.81)％、(12.734±2.97)％、(12.604±2.66)％,除了IL-7组的扩增比例较对照组降低以外,其余各组NK细胞的比例均较对照组提高。细胞表面NKG2D、NKP44、NKP30的表达率分别为(37.974±1.93)％、(7.034±0.83)％、(4.304±1.65)％；(64.004±6.34)％、(8.934±0.89)％、(7.304±1.65)％；(52.73±10.39)％、(1.90±O.60)％、(7.374±2.50)％；(64.404±12.52)％、(6.034±0.49)％、(6.404±1.06)％；(70.374±13.16)％、(6.804±0.90)％、(5.234±3.81)％；(74.434±11.63)％、(8.004±1.25)％、(6.384±5.99)％,除了IL-7组,其余各组均能提高细胞表面NKG2D的表达。
　　 3.RT-PCR结果显示B-F组NK细胞NKG2D和NKP46基因的表达和A组(对照组)比较无统计学差异。
　　 4.效靶比20:1时,A—F组NK细胞对RPMI8226细胞的杀伤率分别为(2.13+0.42)％、(58.73+1.80)％、(1.90+0.60)％、(14.43+1.22)％、(34.27+2.35)％、(37.47+0.60)％。除了C组(IL-7),B组(IL-2)、D组(IL-21)、E组(IL-2+IL-7)和F组(IL-2+IL.7+IL-21)对RPMI8226细胞的杀伤率较A组(对照组)显著增强,与A组比较均有显著统计学差异。其中,IL-2组的杀伤作用最强。
　　 结论:
　　 1.单因子IL-2、IL-21,双因子IL-2+IL.7和多因子IL-2+IL-7+IL-21能提高NK细胞对人骨髓瘤RPMI8226细胞的杀伤活性。其中,单因子IL-2最能增强NK细胞的杀伤活性。
　　 2.其机制可能与细胞因子提高了NK细胞的数量和其细胞表面活化性受体NKG2D的表达量有关。