内皮素受体拮抗剂对肝硬化大鼠转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

摘要

目的:
　　 肝硬变(Liver cirrhosis)是指肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生。正常肝小叶结构的减少、消失是所有形式肝硬变的最重要特点。同时可见显著的肝实质坏死，弥慢的纤维结缔组织沉积，不同程度的再生增殖结节，正常肝小叶减少、结构紊乱（片状坏死、连接汇管区门静脉与中央静脉的桥状坏死），血流动力学改变（缘于肝实质坏死、肝内门体分流、纤维间隔的形成）。肝硬变的具体机制包括：肝小叶内，汇管区门静脉周围的纤维增殖；肝细胞损害引起的纤维化；肝小叶及桥状坏死引起的网状纤维支架塌陷（胶原纤维并没有增加）；新生纤维增多，降解减少；由肝内小胆管增殖引起的纤维化。肝纤维化时，胶原纤维先构建骨架结构，以供其它细胞外基质着床。细胞外基质大量增殖，沉积在狄氏间隙及肝窦间质细胞和肝中央静脉周围，在肝窦内皮下形成一层基底膜，妨碍肝窦血流与肝细胞间物质交换。最终，肝小叶结构改变，肝内小血管狭窄及阻塞，门静脉压力增高。肝星状细胞在肝硬化门静脉高压的发生发展中具有重要作用。活化的肝星状细胞的细胞迁移和粘附以及炎性细胞趋化反应增强，粗面内质网及细胞形态结构发生变化，转化为肌成纤维样细胞，分泌大量以Ⅰ型胶原为代表的细胞外基质，在肝脏纤维化增殖，尤其是肝小叶内纤维化方面发挥重要作用。在分子水平，此过程受到多种细胞因子的调节，其中转化生长因子β1由于具有强大的成纤维作用而受到关注，转化生长因子β1可通过多种信号途经活化肝星状细胞，激活Ⅰ型胶原启动子，增加Ⅰ型胶原mRNA的表达。
　　 内皮素是1988年日本学者在猪主动脉内皮细胞培养上清液中分离出的一种强烈血管活性肽，参与血管张力的维持及全身血流动力学调节，其在心血管疾病治疗中的作用已得到广泛认可。它是一组由21个氨基酸组成的小分子活性肽家族，主要包括3种异构体，内皮素-1、内皮素-2、内皮素-3，其中内皮素-1的血管作用最强。同时，内皮素还具有强烈的促生长和致纤维化作用。内皮素的作用主要由2种亚型的受体介导，即内皮素A和内皮素B受体。在肝脏，内皮素A受体主要分布于肝星状细胞，而内皮素B受体均匀分布于肝星状细胞和窦内皮细胞。在肝硬变患者，血浆内皮素浓度明显增高，而且内皮素升高的程度与肝硬变的严重度，是否有腹水，是否有肝肾综合征均有关。肝硬化患者血浆内皮素浓度增高，其受体mRNA表达平行升高，肝星状细胞活化，内皮素引起活化的肝星状细胞收缩性增强，导致肝内血管阻力和门静脉压力的增加，可能是门静脉高压形成的重要病理机制之一；另一方面，内皮素促使肝星状细胞向成纤维细胞转化，分泌以Ⅰ型胶原为代表的细胞外基质，从而在肝硬化的发展中发挥重要作用。因此，对内皮素诱导的肝星状细胞收缩性进行抑制有可能成为治疗肝硬化门静脉高压症的新途径。随着对内皮索在肝硬化门脉高压发生和发展中重要作用认识的深入，抑制内皮素作用的方法也迅速发展。目前主要有，内皮素受体拮抗剂和内皮素转换酶抑制剂。由于大部分内皮素-1可由非内皮素转换酶介导转化为内皮素-1，所以影响了ECE抑制剂的有效性，限制了其使用。目前研究较多的是内皮素受体拮抗剂，本实验旨在观察四氯化碳诱导的肝硬化大鼠肝组织TGFβ1和Ⅰ型胶原(CollagenDmRNA表达的变化，以及内皮素受体拮抗剂对其表达的影响。探讨内皮素与转化生长因子β1在肝硬化门脉高压形成中的作用及其机制。
　　 材料与方法:
　　 1主要试剂四氯化碳，分析纯，分子量153.82，北京化工厂。药品BQ-123,BQ-788购自CALBIOCHEM公司。RT-PCR相关试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。
　　 2动物模型制备及实验分组40只清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠购自郑州大学动物实验中心，体重370-400g。采用随机数字法分为正常对照组：(NL，n=8)，普通饲养，不做任何处理；其余32只制备肝硬化模型（质量分数50％的四氯化碳，按3ml/kg体重灌胃，间隔6d/次，共10次）。模型组32只大鼠进一步分为：模型对照组(CCl4，n=8)、内皮素A受体拮抗剂组(ETRAa，n=8)、内皮素B受体拮抗剂组(ETRBa，n=8)，联合治疗组(ETRA+B，n=8)，后3组内皮素受体拮抗剂处理每天2次（间隔10h），分别皮下注射内皮素受体拮抗剂BQ-123(12.5μg/Kg,10nmol/min)和BQ-788(15μg/Kg,10nmol/min)，以及BQ-123+BQ788(12.5μg/kg±15μg/kg，10nmol/min)。依据前期的试验，上述BQ-123及BQ-788的应用剂量可使血药峰值浓度达到10-7mol/L，此浓度将能够产生最大的阻断作用。最后一次CCl4灌胃3d后，禁食12h，1％戊巴比妥钠50mg/Kg腹腔注射麻醉。取部分肝组织经10％甲醛固定后行常规病理学检测，剩余肝组织置液氮保存，准备提取总RNA。
　　 3肝组织Collagen ImRNA和TGFβ1mRNA测定
　　 ①肝组织总RNA的提取：采用TRIZOL试剂提取肝组织总RNA。分光光度计测定提取的总RNA含量及纯度，要求OD260/OD280值在1.8-2.0之间。
　　 ②逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)：取肝组织总RNA4μg，ThermoScriptTMRT总反应体系20μl，于65℃反应1h.
　　 ④多聚酶链反应：取逆转录产物cDNA1μl，总体积25μl，进行PCR扩增。反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，72℃后延伸7min。
　　 ⑤扩增产物的定量分析：RT-PCR结果可见443bp和298bp的DNA扩增特异条带，分别为大鼠肝组织Collagen I-cDNA和TGFβ1-cDNA片段，以Kodak120凝胶成像系统对DNA扩增带进行图像分析，以Collagen I/GAPDH和TGFβ1/β-actin的比值表示Collagen I mRNA和TGFβ1mRNA的相对表达量。
　　 4统计学处理采用SPSS18.0统计软件对数据进行分析处理，计量资料采用均数±标准差(-x±s)表示，多组间均数比较采用随机单位组设计资料的方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 ①病理结果：正常对照组肝小叶结构正常，肝细胞未见变性及坏死等病变，个别汇管区散在少数淋巴样细胞及单核细胞浸润。CCl4肝硬化模型组炎症反应最重，肝组织正常小叶结构消失，肝实质被纤维隔包绕，分割成大小不等的假小叶，可见较大范围弥漫的肝损害。内皮素受体拮抗剂应用组较模型对照组肝脏炎症反应及纤维化明显减轻，可见散在分布的纤维隔以及汇管区炎性细胞浸润。
　　 ②内皮素受体拮抗剂对肝硬化大鼠肝组织TGFβ1mRNA表达的影响：肝组织TGFβ1mRNA表达的研究表明：模型对照组肝组织TGFβ1mRNA表达升高142％，显著高于正常对照组（0.75±0.15vs.0.31±0.05，P＜0.05）；内皮素A受体拮抗剂组、内皮素B受体拮抗剂组和联合治疗组，其肝组织TGFβ1mRNA表达水平均低于模型对照组，其中联合治疗组TGFβ1mRNA表达水平最低，降低约28％但尚无统计学显著性差异（P＞0.05）。
　　 ③内皮素受体拮抗剂对肝硬化大鼠肝组织I型胶原mRNA表达的影响：肝组织Collagen I mRNA表达的研究表明：模型对照组肝组织Collagen I mRNA表达较正常对照组显著升高（0.87±0.17vs.0.43±0.08，P＜0.05）；应用内皮素受体拮抗剂后，无论是内皮素A受体拮抗剂组、内皮素B受体拮抗剂组或联合治疗组，其肝组织Collagen I mRNA表达水平均低于模型对照组，P＜0.05。且联合治疗组组CollagenⅠmRNA表达水平最低，降低达37％。
　　 结论:
　　 内皮素受体拮抗剂能有效抑制肝星状细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达，在缓解肝硬化的发生和发展，门静脉压力的控制中发挥重要作用。