mTOR siRNA及雷帕霉素对宫颈癌Hela细胞mTOR、4EBP1表达影响的研究

摘要

背景和目的:宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内,每年约有20万女性死于宫颈癌,严重危害女性的健康。宫颈癌发病隐匿,侵袭性强,多伴有早期淋巴结转移,复发率高,预后差。雷帕霉素靶蛋白(target of rapamyein, TOR)是一类高度保守的蛋白激酶家族,普遍存在于生物界的各种生物中。TOR基因最早在酵母中被发现,随后在哺乳动物细胞中也发现了结构和功能相似的TOR蛋白,命名为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein, mTOR)。mTOR基因定位于1p36.2,是Ser/Thr蛋白激酶家族成员之一,分子量为289kD,由2549个氨基酸组成,因为其C端结构域与磷脂酞肌醇3-激酶(P13K)的催化结构域高度同源,亦属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase, PIKK)家族,在识别信号、信号传导、细胞生长与分裂增殖中起着关键作用。尤其是mTOR作为磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P13K/Akt/mTOR)信号转导通路的下游效应子,其所介导的信号转导通路及其调控的相关癌基因与抑癌基因的异常表达与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。研究表明,在人食管癌、肺癌、乳腺癌及肾细胞癌等实体肿瘤中均存在mTOR的过表达;另有研究表明,在宫颈癌细胞系中存在mTOR信号通路的异常激活,并在宫颈癌组织中呈现高表达状态。细胞的转化控制在调节细胞生长的过程中起到关键的作用。mRNA结合翻译因子(eIF4s)根据其不同的特性可以选择性进行调节,特别是在某种程度上可以抑制其5’端非翻译区的二级结构的不同的mRNA的翻译。eIF4E的过度表达导致细胞转化或无序增长。它也增强了某些mRNA的翻译,包括细胞周期蛋白D1(CyclinD1)。eIF4E的表达下降,导致细胞的生长率降低。转化细胞表达的eIF4E的水平升高。然而,如何控制eIF4E的磷酸化和信号转导通路中的作用仍有待研究。ras基因可导致eIF4E的磷酸化增加,eIF4E的表达下降时的Ras转化细胞的能力减少,这意味着eIF4E的是RAS介导转化的一个重要介质。最近发现eIF4E的抑制剂(eIF4E的结合蛋白,4EBP1/2),又增加了该信号传导途径的功能和作用。虽然4EBP1在细胞转化中的作用(或阻滞作用)尚不十分清楚,但这些研究仍然是令学者们感兴趣的。还应当指出,4EBP1可能受到p70S6K传导通路的控制,它在其中起到细胞周期进程的调控作用。目前mTOR及4EBP1已成为抗肿瘤领域研究的热点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)在mRNA水平,以双链RNA(double strand RNA, dsRNA)为工具,诱导特异性基因沉默的过程,即序列特异性转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGSRNA)。dsRNA在细胞内特异性核酸酶(Dicer)作用下,裂解为小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),约有21bp-23bp的siRNA和多聚核酸酶螯合,形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silence complex, RISC),后者和siRNA结合,有似RNA酶的作用使mRNA降解。RNAi技术因具有精确、高效、操作简单的特点,而被广泛应用于基因功能研究、抗肿瘤、抗病毒、信号传导通路和基因治疗,RNAi有望成为生命科学及基因工程研究的重要工具。雷帕霉素(Rapamycin)是从细菌Streptomyces hygroscopicus中分离提取出来的一种新的大环内酯类免疫抑制剂,经不同的细胞因子受体达到阻断信号传导的作用,阻断T淋巴细胞以及别的细胞从G1期到S期的进程,发挥免疫抑制效应。雷帕霉素也是mTOR的特异性抑制剂,通过与FKBP(FK506结合蛋白)结合,抑制mTOR的表达,同时间接抑制了其下游相关癌基因与抑癌基因的转录和翻译,具有一定的抗肿瘤作用。本研究采用免疫组化SP法检测45例宫颈鳞癌组织、20例CIN组织、30例正常宫颈鳞状上皮组织中mTOR的蛋白表达;应用RNAi技术及雷帕霉素处理宫颈癌Hela细胞,运用免疫细胞化学、原位杂交等技术检测处理前后Hela细胞中·mTOR蛋白及mRNA的表达;通过Boyden chamber体外侵袭实验,了解mTOR siRNA转染后Hela细胞的侵袭力改变,为雷帕霉素靶向治疗宫颈癌和RNAi技术的临床应用提供了理论依据。
　　材料与方法:1.采用免疫组织化学方法检测45例宫颈癌组织、20例CIN组织和30例正常宫颈鳞状上皮组织中mTOR蛋白的表达情况,并进行形态学观察。2.宫颈癌Hela细胞的培养:复苏宫颈癌Hela细胞,以10％胎牛血清培养液(RPMI-1640含青霉素100u/ml、链霉素100u/ml)在37℃、5％CO2的条件下在孵箱贴壁培养。3.合成、鉴定mTOR siRNA:先设计合成siRNA的核苷酸模板,T7RNA聚合酶与5端T7启动子序列在体外特异性结合,目的siRNA被转录后合成一段无义的对照siRNA和两段特异性siRNA,4％琼脂糖凝胶电泳,参照模板为DNA,检测合成siRNA的浓度和碱基长度;筛选效果好特异性siRNA。4.用LipofusinX脂质体把siRNA转染给Hela细胞。5.应用免疫细胞化学及原位杂交技术检测转染mTOR siRNA前后及雷帕霉素处理前后宫颈癌Hela细胞中mTOR、4EBP1mRNA和蛋白的表达。6.通过Boyden chamber体外侵袭实验观察转染siRNA前后各组细胞侵袭力的改变。7.统计学处理:计量资料用均数土标准差(X±S)表示,应用SPSS15.0软件处理,各组间率的比较采用χ2检验,采取方差分析来检验各组均数间差异的统计学意义,组间比较使用t检验,方差不齐时先进行变量转换,显著性标准为α=0.05。
　　结果:1.合成两条长度均为21bp siRNA。2.细胞形态学变化:对照组细胞形态较一致,均呈不规则多边形,轮廓清晰。与各对照组相比,经雷帕霉素处理后,细胞体积缩小,胞质减少,有的呈狭长的梭形,部分细胞漂浮,生长变慢,这些变化随着药物浓度增加及作用时间延长而更加明显;转染mTOR siRNA后细胞皱缩,逐渐变圆,折光增强,细胞边界模糊,间隙增宽,继而出现悬浮细胞,随着转染浓度的增加和作用时间的延长,上述变化亦更加明显。3.免疫组织化学结果:mTOR蛋白阳性表达主要位于宫颈癌细胞质中,mTOR蛋白在30例正常宫颈上皮组织、20例CIN组织和45例宫颈癌组织中的阳性表达率分别为36.7％(11/30)、55.0％(11/20)和71.1％(32/45),正常宫颈组和CIN组与宫颈癌组比较差异有统计学意义(P<0.05)。mTOR蛋白的阳性表达率与宫颈癌的病理分级无关(P＞0.05)。在FIGO分期Ⅰ期至Ⅱ期的宫颈癌中mTOR的阳性表达率为50.0％(8/16)和82.8％(24/29),两组间阳性表达率比较有显著性差异(P＜0.05)。不伴有淋巴结转移组为61.3％(19/31),伴有淋巴转移组为92.9％(13/14),两组间阳性表达率比较差异有统计学意义(P＜0.05)。4.各组细胞mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达情况。4.1与正常对照及溶剂对照组相比,三种不同浓度(100nmol/L,150nmol/L,200nmol/L)的雷帕霉素处理宫颈癌Hela细胞24h、48h、72h,各组细胞mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达均有所下降,差异有统计学意义(P均＜0.05);同一时间段内,随着雷帕霉素浓度增加,细胞,mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达均较对照组细胞减弱,各实验组与对照组相比,差异有统计学意义(P均＜0.05);同一浓度处理组中,随着时间延长,mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达也逐渐降低,各实验组与对照组相比,差异有统计学意义(P均＜0.05)。4.2与正常对照组、空白对照组与无关对照组及相比,三种不同浓度的mTOR siRNA分别转染宫颈癌Hela细胞24h、48h、72h,各组细胞mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达均减弱,差异有统计学意义(P均＜0.05);同一时间段内,随着mTOR siRNA转染浓度增加,细胞mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达均较对照组细胞减弱,各实验组与对照组相比,差异有统计学意义(P均＜0.05);同一转染浓度组中,随着时间延长,细胞中mTOR、4EBP1蛋白及mRNA的表达也逐渐降低,各实验组与对照组相比,组间差异均具有统计学的意义(P均＜0.05)。5.Boyden chamber体外侵袭实验结果:转染mTOR siRNA的Hela细胞,Matrigel穿越的细胞数比无关和空白对照组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:1.mTOR蛋白的过表达可能与宫颈癌发生、发展和浸润、转移密切相关。2.雷帕霉素、mTOR siRNA均可特异性抑制宫颈癌Hela细胞中mTOR蛋白及mRNA的表达。3.mTOR siRNA在下调宫颈癌Hela细胞中mTOR基因表达的同时,4EBP1蛋白及mRNA的表达亦随之下调,提示mTOR作为4EBP1的上游调控因子,可特异性调节4EBP1的表达。4. mTOR siRNA可抑制宫颈癌Hela细胞的侵袭力。

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综述

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攻读硕士学位期间发表论文