CHD1L在食管鳞癌中的表达及临床意义和CHD1L在食管癌细胞系中的表达

摘要

背景与目的：
　　 食管癌是人类最常见的六大恶性肿瘤之一,是中国恶性肿瘤致死率排名第四,世界恶性肿瘤死亡率第四的肿瘤。它的分布表现为明显的区域性特征,在我国主要集中在太行山区一带,发病率由高到低呈同心圆向外分布。其中,河南安阳林州市和其毗邻的辉县是我国乃至是世界上发病率最高的两个地区,且以食管鳞状细胞癌为主。由于食管癌的发病率高,预后极差,其病因学研究引起了世界尤其是中国学者的广泛关注。食管癌的发生与其他肿瘤一样,也是一个多基因多步骤的过程。在细胞发生癌变的过程中,细胞周期中的多种调节因子对细胞的癌变具有作用。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础。正常情况下,细胞原癌基因在维持细胞信号转导和增殖过程中起着重要作用。当原癌基因被激活转变为癌基因时,通过高表达或表达功能异常的蛋白产物致癌。目前发现与食管癌相关的癌基因主要有:Ras,C-myc,EGFR,c-Jun,MDM2,MTA1,hFRI,c-fos,CyclinD,C-erbB2,int-2等。
　　 CHD1L(Chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein1-tike gene)是香港大学关新元教授用染色体显微切割技术结合比较基因组杂交技术,首次从人体肝癌细胞的染色体1q21区分离并克隆的一个新基因。该基因又被称为ALC1(Amplifled iIl liver cancer1,基因库登记号AF537213),基因全长2980bp,编码89kDa分子蛋白。研究发现CHD1L在肝癌常常呈现高表达,且通过对转染了该基因的细胞相关功能实验及其分子机制的研究,进一步证实了CHD1L可能作为一个新的肝癌候选基因出现。但是,CHD1L基因与食管癌的发生发展关系的相关报道尚未发现。关于CHD1L在肝癌方面的研究表明CHD1L主要通过下调p53及其下游效应基因p21、上调Cdk2以及CyclinE等基因表达,促进DNA合成及G1/S周期转换,从而调控细胞的增殖和凋亡过程,导致肿瘤的发生。本实验研究采用半定量PCR(RT-PCR)和荧光实时定量PCR(q-PCR)在mRNA水平检测CHD1L在食管鳞状细胞癌的表达情况;采用免疫组化的方法检测CHDlL在食管鳞癌中蛋白水平的表达情况,从而进一步深刻探讨该基因的临床意义。并且通过半定量PCR和荧光实时定量PCR检测该基因在食管癌细胞系中的表达,筛选出表达较低的食管癌细胞系KYSE30和KYSE510,以及显著高表达的食管癌细胞系KYSE180和HKESC1,G418和puromycin分别筛选以上细胞株的最佳药物浓度,为下一步筛选稳定克隆和功能和分子机制研究奠定基础。
　　 材料与方法：
　　 1.选取河南省林州市人民医院2010年7月至2010年10月期间50例食管癌手术标本及其相应的癌旁食管正常粘膜组织(食管正常粘膜组织距离病灶＞5cm),以及来源于该院2002年2月至2008年12月期间的289例食管癌石蜡包埋标本。所有手术标本HE切片病理学检测均证实为食管鳞癌。以上所有病例手术前均未经过放疗、化疗和免疫治疗。
　　 2.采用半定量PCR及荧光实时定量PCR方法检测50例食管鳞癌组织及其相应的癌旁食管正常粘膜组织中CHD1LmRNA的表达情况。
　　 3.采用免疫组织化学法检测289例食管鳞癌组织及其相应的癌旁食管正常粘膜组织中CHD1L蛋白的表达情况。
　　 4.采用SPSS16.0统计软件包,统计方法采用独立Student's检验、Chi-square检验,检验水准为a=0.05。Kaplan-Meier分析CHD1L表达与食管癌患者的生存关系。
　　 5.采用半定量PCR及荧光实时定量PCR方法检测7株食管癌细胞系中CHD1L的表达,筛选出表达最高的两株细胞株及表达最低的两株细胞株。
　　 6.G418筛选表达低的KYSE30及KYSE510两株食管癌细胞系的最佳药物浓度;puromycin筛选表达高的食管癌细胞系KYSE180和HKESC1的最佳药物浓度。
　　 结果：
　　 1.50例食管鳞状细胞癌组织及其相应的癌旁食管正常粘膜组织中,31例食管鳞癌组织CHD1L的表达高于相应的癌旁正常组织62.0％(31/50);5例食管鳞癌组织CHD1L的表达低于相应的癌旁正常组织10%(5/50)。PCR结果显示:CHD1L在mRNA水平的表达在食管鳞癌组织及其相应的癌旁食管正常粘膜组织间的差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　 2.免疫组织化学结果显示:在245例食管鳞状细胞癌组织中,102例染色阳性(41.6%),143例染色阴性(58.4%);在245例食管鳞状细胞癌相应的癌旁食管正常粘膜组织中,52例染色阳性(21.2%),193例染色阴性(78.8%)。CHD1L蛋白在食管鳞癌组织中的表达率为41.6%(102/245),明显高于其相应的癌旁食管正常粘膜组织21.2%(52/245),且差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　 3.245例食管鳞状细胞癌中,Tis组CHD1L蛋白高表达率为25.0%(1/4),T1组CHD1L蛋白高表达率为1/14(7.1%),T2组CHD1L蛋白高表达率为5/19(26.3%),T3组CHD1L蛋白高表达率为25.0%(13/52),T4组CHD1L蛋白高表达率为52.6%(82/156),根据浸润深度CHD1L蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.05);Ⅲ～Ⅳ期食管鳞状细胞癌CHD1L蛋白高表达率为60.0%(48/80),明显高于0～ⅡB期32.7%(54/165),两者之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。有淋巴结转移组的CHD1L蛋白的高表达率为52.4%(55/105),明显高于无淋巴结转移组33.6%(47/140),且两者之间的差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　 4.245例食管鳞状细胞癌标本中,CHD1L蛋白表达异常与年龄、性别、分化级别无关(p＞0.05)。
　　 5.CHD1L蛋白高表达的食管鳞癌患者的5年生存率(28.8%)明显低于CHD1L蛋白正常表达的食管鳞癌患者(36.7%,p＜0.05)。
　　 6.KYSE30、KYSE410、KYSE510三株食管癌细胞株CHD1LmRNA表达相对较低,EC18、KYSE180、HKESC1、KYSE140四株食管癌细胞株CHD1LmRNA呈现显著高表达。
　　 7.食管癌细胞株KYSE30 G418的最佳药物浓度为500ug/ml,KYSE510 G418的最佳药物浓度为800ug/ml。食管癌细胞株KYSE180 puromyein的最佳药物浓度为0.3ug/ml,HKESC1 puromycin的最佳药物浓度为0.1ug/ml。
　　 结论：
　　 1.食管鳞状细胞癌组织中CHD1L呈现高表达,其表达增高与食管鳞癌浸润深度、临床分期、淋巴结转移密切相关,且与患者的五年生存率有关,提示CHD1L可能与食管鳞状细胞癌的发生发展和预后有关。
　　 2.筛选CHD1L在食管癌细胞系中的表达,筛选KYSE30和KYSE510的G418最佳药物浓度,KYSE180和HKESC1的puromycin最佳药物浓度,为下一步筛选稳定克隆及功能和分子机制研究奠定基础。