丙型肝炎病毒感染慢性化的免疫学机制研究

摘要

研究背景：
　　 慢性丙型肝炎是严重危害人类健康的疾病之一。尽管目前世界范围内对于慢性丙肝防治理论与方法上取得了长足进展，但HCV感染慢性化的免疫学机制研究的不是十分透彻，持续的病毒血症导致感染后丙型肝炎肝硬化、丙型肝炎肝癌的发生。免疫应答在丙型肝炎的发病机制中起重要作用。细胞免疫功能异常可能是造成病毒持续感染的主要原因之一，尤其是淋巴细胞数量和功能的异常是HCV感染慢性化的重要原因。
　　 目的：
　　 研究慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴细胞上抑制性受体PD-1表达情况与健康人群的差异，及在中心记忆细胞、效应记忆性细胞、效应细胞表面的表达情况，同时检测抗病毒治疗后12周、48周PD-1在CD4+、CD8+的T淋巴细胞表面及记忆性细胞、效应细胞表达情况与抗病毒治疗前的差异;研究CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞在慢性丙型肝炎患者外周血分布频率与健康人群的差异，及抗病毒治疗后12周、48周其分布频率的变化;研究HLA-A2抗原在慢性丙型肝炎患者+率的高低，为进一步进行HCV特异性肽段刺激做准备;研究基因1b型的HCVNS31406-1415及HCVNS31073-1081两条肽段刺激慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴细胞后，CD4+、CD8+的T淋巴细胞分泌穿孔素、颗粒酶、干扰素-γ的杀伤能力。
　　 材料和方法：
　　 1.1.选择慢性丙型肝炎患者34例为研究对象，用肝素钠试管收集抗病毒治疗基线、抗病毒治疗12周、48周时外周血标本，应用密度-梯段离心法提取单个核细胞，依照CD45RA及CD27分子在CD4及CD8+的T淋巴细胞表面的表达情况将细胞分为4群，分别是原始细胞(CD4+CD27+CD45RA+)、中心记忆细胞（CD4+CD27+CD45RA-）、效应记忆性细胞（CD4+CD27-CD45RA-）、效应性细胞(CD4+CD27-CD45RA+)/原始细胞(CD8+CD27+CD45RA+)、中心记忆细胞（CD8+CD27+CD45RA-）、效应记忆性细胞（CD8+CD27-CD45RA-）、效应性细胞（CD8+CD27-CD45RA+）。将PE-CY7标记的CD3、APC-CY7标记的CD4、PerCP标记的CD8、APC标记的CD45RA、FITC标记的CD27、PE标记的PD-1抗体加入提取出的细胞内，振荡均匀，室温，避光，孵育20min。
　　 1.2.转移细胞至上样管内，在流式细胞仪检测PD-1在各群细胞的表达情况。
　　 1.3.复苏慢性丙型肝炎患者及健康对照外周血单个核细胞，将FITC标记的CD4及PE标记的CD25抗体各1.5μl，先后加入准备好的含有细胞的EP管内，同时设立同型对照。
　　 1.4.经过固定、破膜处理后加入胞内染色剂APC-FOXP3抗体1.5μl，室温孵育20min。
　　 1.5.转移细胞至上样管内，流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在慢性丙型肝炎患者及健康对照人群分布频率。
　　 2.1.同样应用密度-梯度离心法，选取110例CHC患者外周血标本提取单个核细胞，取FITC标记的CD3及PE标记的HLA-A2抗体各1.5μl加入细胞，室温、避光孵育20min。
　　 2.2.将孵育好的细胞转移至上样管，流式细胞仪进行HLA-A2分型检测。
　　 3.1.将1×105/ml的细胞铺在24孔板中，分别加入基因1b型NS31406-1415及NS31073-1081肽段和细胞共孵育24h。
　　 3.2将孔板中一组孔内加入阻断剂，另一组孔不加阻断剂，孵育4-5个h后收获细胞于1.5ml的EP管中，加入PE-Cy7标记的CD3、APC-Cy7标记的CD4、PerCP标记的CD8抗体各1.5μl加入EP管内，振荡均匀，室温，避光，孵育20min。
　　 3.3将细胞经过固定、破膜处理后，将未加阻断剂的细胞加入FITC标记的Perforin（穿孔素）、将加入阻断剂的细胞内加入PE标记的Grazyme（颗粒酶）B、APC标记的Interferon-γ抗体，室温、避光孵育30min。
　　 3.4将细胞转移至上样管内，流式细胞仪检测CD4及CD8+的细胞分泌穿孔素、颗粒酶及干扰素-γ的水平
　　 结果：
　　 1.PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴细胞表面的表达水平高于健康对照组(t=3.837，P=0.0007)，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞表面的表达水平高于健康对照组(t=2.142，P=0.043);PD-1在CD4+T淋巴的中心记忆性细胞(t=2.498，P=0.0213)、效应记忆性T细胞(t=5.239，P=0.0001)、效应细胞(t=3.634，P=0.0014)表面表达均高于健康对照组;PD-1在CD8+T淋巴的中心记忆性细胞(t=3.688，P=0.0015)、效应记忆性T细胞(t=3.088，P=0.0058)、效应细胞(t=4.455，P=0.0002)表面表达均高于健康对照组。
　　 2.慢性丙型肝炎患者治疗至12周时，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴细胞(t=4.108，P=0.0002)表面表达高于健康对照组，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞(t=2.071，P=0.0458)表面表达高于健康对照组;在CD4+中心记忆性细胞(t=2.761，P=0.0129)、效应记忆性T细胞(t=2.618，P=0.0174)、效应细胞(t=2.601，P=0.0174)表面表达均高于健康对照组;PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞的中心记忆性细胞(t=2.260，P=0.0364)、效应记忆性T细胞(t=4.331，P=0.0004)、效应细胞(t=4.346，P=0.0003)表面表达均高于健康对照组。
　　 3.慢性丙型肝炎患者治疗至48周时，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴细胞(t=0.00302，P=0.9702)，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞(t=0.098，P=0.9231)表面表达与健康对照组无明显差异;PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+的中心记忆性细胞(t=1.239，P=0.2312)、效应记忆性T细胞(t=0.8306，P=0.4155)、效应细胞(t=0.5457，P=0.5920)表面表达均与健康对照无明显差异，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+中心记忆性细胞(t=0.9505，P=0.3544)、效应记忆性T细胞(t=0.3535，P=0.7278)、效应细胞(t=0.2533，P=0.8029)表面表达均与健康对照无明显差异;与慢性丙型肝炎患者治疗至12周时比较，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+中心记忆性细胞(t=2.441，P=0.0252)、效应记忆性T细胞(t=2.852，P=0.0095)、效应细胞(t=3.079，P=0.0065)表面表达明显降低;与慢性丙型肝炎患者治疗至12周时比较，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+中心记忆性细胞(t=4.849，P=0.0001)、效应记忆性T细胞(t=6.723，P=0.0001)、效应细胞(t=7.569，P=0.0001)表面表达明显降低。
　　 4.CD4+CD25+Foxp3+Treg在慢性丙型肝炎患者外周血分布频率高于健康对照组(t=3.569,P=0.002)。
　　 5.慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗至12周时CD4+CD25+Foxp3+Treg外周血分布频率仍高于健康对照组(t=2.696，P=0.0132)。
　　 6.慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗至48周时CD4+CD25+Foxp3+Treg外周血分布频率与抗病毒治疗前基线(t=3.407，P=0.0028)、治疗至12周时(t=2.565，P=0.0152)比较明显降低。
　　 7.慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗基线外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg分布频率与HCVRNA载量呈正相关(r=0.6.98，P=0.0016)。
　　 8.HLA-A2抗原阳性率在慢性丙型肝炎患者中分布+率与健康对照组无明显差异，阳性率为39.09％。
　　 9.慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T细胞经NS31406-1415肽段刺激后分泌颗粒酶B(t=2.0807，P=0.0229)干扰素-γ(t=2.561，P=0.0307)及穿孔素(t=4.767，P=0.001)的水平较健康对照人群明显降低;慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T细胞经NS31406-1415肽段刺激后分泌颗粒酶B(t=2.229，P=0.0499)干扰素-γ(t=4.598，P=0.0018)及穿孔素(t=2.387，P=0.0408)的水平较健康对照人群明显降低;慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T细胞经NS31073-1081肽段刺激后分泌颗粒酶B(t=2.564，P=0.0334)、干扰素-γ(t=2.633，P=0.003)及穿孔素(t=2.564，P=0.0334)的水平较健康对照人群明显降低;慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T细胞经NS31073-1081肽段刺激后分泌颗粒酶B(t=3.008，P=0.0148)、干扰素-γ(t=2.922，P=0.0192)及穿孔素(t=2.818，P=0.0201)的水平较健康对照人群明显降低。
　　 10.与健康对照组相比较，慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴细胞增殖能力低下，二者差异有统计学意义;与健康对照组相比较，慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞增殖能力低下，二者差异有统计学意义。
　　 结论：
　　 1.PD-1在慢性丙型肝炎患者治疗前基线表达于外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞表面及CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞中心记忆细胞、效应记忆细胞、效应细胞水平明显高于健康对照组，经抗病毒治疗后连续观察抗病毒治疗至12周、48周PD-1在上述各群细胞表达明显降低，抑制性分子的表达上调反应了慢性丙型肝炎患者体内T细胞功能的缺陷。
　　 2.外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg分布频率经抗病毒治疗后亦呈现进行性减少趋势，CD4+CD25+Foxp3+Treg可能参与了HCV感染慢性化的发病过程。
　　 3.经HCV特异性肽段刺激后，慢性丙型肝炎患者外血T淋巴细胞杀伤能力减弱，且慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T、CD8+T淋巴细胞增殖能力较健康对照患者差，慢性丙型肝炎患者T细胞增殖和杀伤功能的减弱是HCV感染慢性化的重要因素。上述因素是慢性丙型肝炎患者持续病毒血症的重要免疫学原因。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第一部分 慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗基线、发生早期病毒学应答时及治疗至48周外周血T淋巴细胞表面抑制性受体表达情况分析

前言

1 对象和方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

第二部分 慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗基线、发生早期病毒学应答时及治疗至48周体内Treg细胞外周血分布状况的研究

前言

1 对象和方法

2．3 结果

2．4 讨论

结论

参考文献

第三章 慢性丙型肝炎患者HLA-A2表型的研究

前言

1 对象和方法

2 统计学处理

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

第四部分 慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴细胞经肽段刺激后杀伤功能及T细胞增殖能力的研究

前言

1 对象和方法

2 结果

结论

参考文献

全文总结

综述一 慢性丙型肝炎患者HCV感染慢性化的免疫学机制的研究

综述二 Insight into host T cell exhaustion against chronic HCV infection

致谢

个人简历及在读期间发表文章