RNA干扰p70S6K表达对食管鳞癌EC9706细胞影响的体内外研究

摘要

背景与目的:
　　 食管癌是一种由食管鳞状上皮或腺上皮异常增生导致的恶性肿瘤。不同国家与地区食管癌的发病率不一。据统计，世界上每年约有20万人死于食管癌。在我国因肿瘤死亡的人数最多的是胃癌，其次就是食管癌。对于食管癌的治疗手段主要是放射治疗、化学治疗及手术切除。目前，除在癌症发生的早期阶段切除肿瘤组织能达到根治外，其他的治疗效果并不理想。但是，人们尚未完全弄清楚食管癌确切的发病机制，这使得食管癌的早期诊断与抗肿瘤药物的研发面临着巨大的挑战。
　　 目前，已有报道mTOR信号通路在食管癌细胞中是异常激活的，推测也许可以从mTOR通路中寻找到食管癌分子治疗的靶点。现在很多研究都集中于mTOR分子，因为雷帕霉素可以直接与其结合，抑制该通路的激活，阻滞细胞周期并诱导细胞产生凋亡。但是mTOR分子量较大(289kDa)，与其作用的蛋白也较多，因此，我们选择了mTOR最重要的下游底物之一p70S6K作为研究对象，利用RNA干扰其表达，通过体内外方法检测干扰前后食管癌细胞对雷帕霉素的敏感性变化，为食管鳞癌的基因治疗提供实验依据。
　　 方法:
　　 1.以p70S6K为研究对象，用Western Blot方法从Eca109、EC9706、KYSR450、TE-1四株食管癌细胞中筛选出p70S6K及p-p70S6K蛋白表达较高的细胞株，然后将p70S6K特异性小片段干扰RNA(p70S6K-siRNA)转染高表达的细胞，通过RT-PCR分析siRNA对细胞中p70S6K的干扰效果，并用MTT法及流式细胞术分别分析干扰前后雷帕霉素对细胞增殖及细胞周期的影响。
　　 2.采用p70S6K-shRNA质粒转染EC9706细胞，经嘌呤霉素筛选得到稳定表达细胞株。通过RT-PCR方法及荧光显微镜检测其干扰效果，然后采用MTT法检测干扰p70S6K前后雷帕霉素对EC9706细胞增殖的影响。
　　 3.将转染p70S6K-siRNA的EC9706细胞、能稳定表达p70S6K-shRNA的EC9706细胞和EC9706细胞分别接种至裸鼠体内，建立动物模型。除对照组外，其余各组用雷帕霉素或顺铂连续治疗18天，记录荷瘤裸鼠体重及肿瘤体积变化，计算抑瘤率。另外，利用Western Blot方法检测不同治疗后肿瘤组织中p70S6K及p-p70S6K蛋白表达的变化。
　　 结果:
　　 1.EC9706细胞中p70S6K及p-p70S6K蛋白表达相对较高，转染p70S6K-siRNA后，p70S6KmRNA及蛋白的表达水平随着转染时间的增加而降低。与各自的对照组相比，转染后的细胞更多地被阻滞在G1期，并且雷帕霉素对转染后细胞的增殖抑制作用更加明显。
　　 2.与未转染的细胞和转染对照shRNA的细胞相比，转染p70S6K-shRNA的细胞中p70S6KmRNA的表达明显降低。p70S6K-shRNA稳定表达株的细胞形态发生了明显的变化:细胞变得更细长，并呈现不规则的长梭形。此外，转染p70S6K-shRNA后，雷帕霉素对细胞增殖的抑制作用更加明显。
　　 3.体内实验中，EC9706雷帕霉素单独治疗组能明显抑制肿瘤生长，p76S6K-siRNA组对肿瘤生长抑制作用不太明显，但二者联用肿瘤生长最慢，效果最好。而p70S6K-shRNA组肿瘤生长速度也比对照组慢，尤其与雷帕霉素联用后，肿瘤生长速度更慢。此外，EC9706顺铂治疗组的肿瘤也小于对照组，与p70S6K-shRNA联用对肿瘤抑制作用强于单用。
　　 结论:
　　 1.体外实验显示，p70S6K在各食管癌细胞株中表达存在差异，RNA干扰其表达后与雷帕霉素具有相似的作用，都能下调p70S6K的表达，使阻滞在G1期的细胞增多，并能抑制细胞的增殖。当RNA干扰p70S6K表达后，EC9706细胞对雷帕霉素更敏感。
　　 2.体内实验结果说明p70S6K-siRNA与p70S6K-shRNA都能提高细胞对雷帕霉素的敏感性，但p70S6K-shRNA干扰后的抑瘤效果比p76S6K-siRNA的弱。

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摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 RNA干扰p70S6K表达对人食管鳞癌细胞影响的体外研究

第一章 雷帕霉素及p70S6K-siRNA对人食管鳞癌EC9706细胞p70S6K基因表达影响的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 shRNA干扰p70S6K表达增强雷帕霉素对人食管鳞癌EC9706细胞的增殖抑制作用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 RNA干扰p70S6K表达对人食管鳞癌细胞影响的体内研究

1 材料和方法

1．1 实验动物

1．2 药品

1．3 实验方法

2 结果

2．1 裸鼠食管鳞癌细胞移植瘤模型的建立

2．2 治疗期间肿瘤生长变化情况和抑瘤率比较

2．3 各组裸鼠肿瘤组织中p70S6K和p-p70S6K蛋白表达情况

3 讨论

综述 70kDa核糖体S6激酶的功能与调控

参考文献

个人简历

致谢