热诱导启动子HSP70B’调控的RNAi表达载体的构建与鉴定

摘要

近年来，基因治疗已成为肿瘤治疗的主要方法之一。在肿瘤基因治疗中，启动子可以通过控制治疗基因表达的时间和水平，达到肿瘤靶向治疗的目的。HSP70B'作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、装配和转运，在肿瘤细胞中表达，参与肿瘤免疫保护作用;而且HSP70B'启动子还表现出独特的热诱导性，它在正常的细胞和组织中不会表达，只有在高温诱导的细胞中才会表达。这一独特的生物学特征，使其在基因工程治疗肿瘤的研究中具有重要的意义。
　　 本实验首先利用PCR技术扩增出HSP70B'启动子，然后将HSP70B'启动子插入到pEGFP-C1载体上构建了载体pEGFP-HSP70B'，然后把重组质粒pEGFP-HSP70B'转染到乳腺癌MCF-7细胞中，通过考察绿色荧光蛋白的表达优化HSP70B'启动子的转录水平。在此基础上，我们又构建了以热诱导启动子HSP70B'启动子调控的靶向hTERT的RNAi表达载体p-shTERT-HSP70B'。将重组质粒用ExGen500转染至乳腺癌细胞MCF-7，考察了重组质粒对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，以及靶向hTERT mRNA的RNAi效应。
　　 实验结果显示诱导温度达到40℃以上时，随着诱导时间的增加绿色荧光蛋白的量增加。当诱导温度达到42℃时，时间为40 min时，绿色荧光蛋白的强度最强，时间继续延长，细胞形态开始变化。诱导温度达到44℃时，我们能明显看到细胞形态发生变化并回缩变圆。重组质粒p-shTERT-HSP70B'在42℃诱导40min条件下，对细胞的抑制率为39.9％;乳腺癌MCF-7细胞hTERT mRNA的抑制率达到了69％;并且其细胞凋亡结果也显示其对肿瘤细胞的抑制率达到了31％，细胞周期抑制阻滞在G1期。
　　 实验结果表明热诱导启动子HSP70B'调控的RNAi表达载体p-shTERT-HSP70B'可以有效的抑制乳腺癌细胞内hTERT mRNA的表达、引起细胞凋亡、影响细胞周期的分布、最终抑制肿瘤增殖。本实验为热诱导启动子HSP70B'在RNAi中的应用奠定了的基础。
　　 热诱导启动子HSP70B'的转录活性需要热量激活，因此可以实现基因治疗和热疗有机结合。有研究表明，经修饰的超短碳纳米管在13.56 MHz的射频场中，可以将射频导微波能量有效转化为热能，从而达到对肿瘤细胞的热损伤。因此，本研究对碳纳米管作为热诱导启动子HSP70B'调控的RNAi表达载体的纳米转运载体的可行性进行了初步探索。我们用小分子量的PEI(MW600)对碳纳米管进行改性，提高其水溶性，负载重组载体p-shTERT-HSP70B'转染乳腺癌细胞。实验通过考察射频条件下，重组质粒对细胞活性、细胞周期和细胞凋亡的影响，以及对hTERT mRNA表达情况的影响，探索碳纳米管的“微波-热”转换效应对热诱导性RNAi效应的影响。实验结果显示，改性碳纳米管作为基因载体并未显著提高RNAi效应，这可能与碳纳米管过长，不能将微波能量有效转换为热能有关，我们将在后续研究中对其进一步优化，为肿瘤治疗探索新的途径和方法。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第二章 pEGFP-HSP70B’载体的构建与鉴定

1 实验材料与试剂

1．1 实验材料

1．2 主要实验仪器

1．3 药品与试剂

2 实验方法

2．1 HSP70B’启动子的扩增

2．2 pEGFP-HSP70B’载体的构建

2．3 pEGFP-HSP70B’载体的验证

2．4 pEGFP-HSP70B’载体的体外细胞实验

3 实验结果

3．1 HSP70B’启动子的PCR扩增

3．2 pEGFP-HSP70B’载体的验证

3．3 不同诱导温度和时间对细胞生长的影响

3．4 pEGFP-HSP70B’体外热诱导表达

4 讨论

第三章 p-shTERT-HSP70B’载体的构建与鉴定

1 实验材料与试剂

2 实验方法

2．1 p-shTERT-HSP70B’载体的构建

2．2 重组质粒p-shTERT-HSP70B’的验证

2．3 MTT法检测细胞抑制率

2．4 RT-PCR

2．5 细胞凋亡实验

2．6 细胞周期实验

3 实验结果

3．1 重组质粒p-shTERT-HSP70B’的验证

3．2 细胞抑制率实验

3．3 p-shTERT-HSP70B’的RT-PCR

3．4 细胞凋亡实验

3．5 细胞周期

4 讨论

第四章 载体SWNT-CO-PEI的制备与性质

1 实验材料与试剂

2 实验方法

2．1 碳纳米管的羧基化

2．2 碳纳米管的酰氯化

2．3 碳纳米管的PEI修饰

2．4 傅立叶红外光谱(FT-IR)

2．5 粒径和电位考察

2．6 SWCNT和SWCNT-CO-PEI热重分析

2．7 SWCNT-CO-PEI与DNA的相互作用

2．8 MTT法测定载体SWCNT-Co-PEI对细胞毒性

2．9 SWCNT-CO-PEI转染细胞实验

2．10 hTERT mRNA表达水平分析

2．11 细胞凋亡

3 实验结果

3．1 碳纳米管的羧基化

3．2 碳纳米管的PEI修饰

3．3 SWCNT和SWCNT-CO-PEI热重分析

3．4 SWCNT-CO-PEI与DNA的相互作用

3．5 SWCNT-CO-PEI的细胞转染实验

3．6 SWCNT-CO-PEI对细胞毒性实验

3．7 p-shTERT-HSP70B’中hTERT mRNA表达水平分析

3．8 细胞凋亡实验结果

4 讨论

第五章 结论

综述

参考文献

个人简历

致谢