靶向c-Met的特异性siRNA联合阿霉素的制剂及其体内外抗癌活性的研究

摘要

肝细胞生长因子受体(Hepatocyte growth factor receptor, c-Met)具有酪氨酸激酶活性，此受体被HGF激活过度表达后对多种细胞的增殖、分化及浸润运动等都有调节作用，并被认为与胃癌的发生、发展、侵袭、转移及不良预后有密切关系。RNA干扰技术已在基因治疗中应用多年，siRNA基因药物具有高特异性及低毒副作用的特点，小量siRNA即可有效沉默目的基因，抑制率较大，在肿瘤治疗中是一颗耀眼的新星。阿霉素(doxorubicin,DOX)是一种葱环类抗生素，广泛用于抗肿瘤的治疗。但其疗效受限于剂量依赖性的心脏毒性，骨髓抑制及多药耐药性。本研究采用功能化的单壁碳纳米管来接载DOX，然后静电吸附阳离子脂质体DOTAP，使制剂形成正电性后，与靶向c-Met的siRNA正负电吸附，同时载带两种药物制成联合药物，以期起到基因治疗与化疗联合作用效果，增强治疗效果的同时降低阿霉素的毒副作用。
　　 本研究首先依据RNAi原理，设计并合成了以c-Met基因为靶点的几条siRNA序列，以胃癌细胞SGC-7901为研究对象，以脂质体LipofectaminTM2000为载体通过体外转染胃癌细胞SGC-7901进行有效序列的筛选。以SRB法检测其对细胞增殖的抑制作用，采用RT-PCR技术检测其对c-Met mRNA表达的抑制作用，筛选出siRNA-3为最为有效的序列。其可明显抑制胃癌细胞SGC-7901的增值，抑制率为39.1％;对c-Met mRNA表达的沉默效率为81.08％。
　　 本研究成功地以表面活性剂分散氧化后的单壁碳纳米管(Oxidized single-walled carbon nanotube，O-SWNTs)，物理吸附阿霉素，形成SWNT-DOX纳米制剂，并对其进行一系列考察。制剂外观较为均一稳定，且载药率高达98％;通过FT-IR研究表明，经过化学修饰在碳纳米管表面稳定形成羧基基团，并且SWNT-DOX制剂中SWNT已将DOX吸附上，形成新的制剂;使用纳米粒度仪测定SWNT-DOX具有良好的粒径分布和理想电位，稳定性良好;体外释放结果表明SWNT-DOX为缓释制剂，且在微酸性介质中释放较快;用SRB法检测碳纳米管载体在一定给药剂量范围内毒性较小，原料药阿霉素在低浓度时细胞毒性较大，而SWNT-DOX在同浓度下抑制作用小于原料药，说明其具有缓释作用，细胞毒减小，在体内作用时可能会减低心脏毒性。
　　 本文的第三部分成功地合成了SWNT/DOX/DOTAP/siRNA联合制剂，使用琼脂糖凝胶电泳确定了SWNT载体系统成功承载了siRNA;利用荧光显微镜、透射电镜及流式细胞术定性及定量的考察了联合制剂中DOX及siRNA进入细胞的能力及多少，结果证明此载体系统可更为有效的递送siRNA进入细胞;通过SRB法检测到联合制剂对细胞的抑制率为78.05％，远远高于同浓度下单独药物的抑制率。通过流式细胞仪对凋亡率的检测结果表明，SWNT/DOX/DOTAP/siRNA载体系统对SGC-7901细胞的凋亡率显著增高。
　　 最后，对SWNT-DOX制剂在体内药物动力学及组织分布情况做了初步考察，发现相较于原料药阿霉素，SWNT-DOX制剂可延长药物在血液的循环时间，半衰期延长，使药效更持久，且可降低小鼠的心脏毒性。对制剂在体内药效学情况做了初步考察，发现联合制剂的抑瘤率最大，与其他对照组都显现出显著性差异。
　　 本研究对SWNT/DOX/DOTAP/siRNA载体系统进行了较为系统的研究，通过各项指标的考察，表明此系统具有良好的联合疗效，且可以降低阿霉素的心脏毒性。由此可见，该联合治疗系统具有显著的优势。该研究为探索肿瘤治疗的新方法提供了重要参考依据。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

1 基因治疗

1．1 基因的传递体系

1．2 胃癌的基因治疗

2 阿霉素的研究现状

2．1 理化性质及药理活性

2．2 阿霉素国内外研究现状

3 碳纳米管作为药物载体的研究现状

3．1 碳纳米管接载化学药物

3．2 碳纳米管接载生物活性分子的研究

4 本课题研究的内容

第一章 靶向c-Met siRNA有效序列的筛选

1 材料与仪器

1．1 细胞株

1．2 试剂

1．3 实验仪器设备

1．4 主要试剂的配制

1．5 PCR引物

1．6 siPNA的设计与合成

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 细胞转染

2．3 SRB法检测siRNA对胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用

2．4 逆转录PCR(RT-PCR)检测siRNA对胃癌SGC-7901细胞c-Met基因mRNA表达的抑制作用

2．5 统计学分析

3 结果

3．1 siRNA对SGC-7901细胞生长的抑制作用

3．2 总RNA的纯度和完整性分析

3．3 siRNA抑制SGC-7901细胞c-Met mRNA的表达情况

4 讨论

第二章 碳纳米管运载阿霉素系统的构建和制剂学研究

1 实验材料与仪器

1．1 材料

1．2 仪器

2 实验方法

2．1 单壁碳纳米管的纯化与羧基化

2．2 表面活性剂对功能化SWNT的分散

2．3 SWNT细胞毒性研究

2．4 阿霉素原料药体外标曲的建立

2．5 阿霉素原料药的细胞毒性研究

2．6 SWNT-DOX纳米混悬液的制备

2．7 SWNT-DOX体外释药研究

2．8 SRB法检测SWNT-DOX纳米混悬液对细胞毒性的影响

3 结果

3．1 羧基化碳纳米管的红外光谱图

3．2 表面活性剂对功能化SWNT的分散

3．3 阿霉素原料药标准曲线的建立

3．4 SWNT-DOX纳米混悬液的体外表征

3．5 SWNT-DOX体外释药曲线

3．6 SWNT细胞毒性研究

3．7 阿霉素原料药的细胞毒性研究

3．8 SWNT-DOX纳米混悬剂的细胞毒性研究

4 讨论

第三章 碳纳米管共载盐酸阿霉素和siRNA制剂及作用于胃癌SGC-7901细胞的制剂学研究

1 实验材料与仪器

1．1 材料

1．2 仪器

2 实验方法

2．1 SWNT/DOX/siRNA联合制剂的制备

2．2 SWNT载体系统的透射电镜实验

2．3 电泳检测SWNT/DOX/DOTAP/siRNA联合制剂中载体对siRNA的包封情况

2．4 细胞摄取实验

2．5 流式细胞仪检测细胞摄取率实验

2．6 SRB法检测SWNT载药系统的细胞毒性实验

2．7 流式细胞仪测定siRNA转染48h后对SGC-7901细胞凋亡的影响

3 检测SWNT/DOX/DOTAP制剂在体外的各项指标结果

3．1 SWNT/DOX/DOTAP制剂的含量测定

3．2 SWNT/DOX/DOTAP制剂的粒径电位

3．3 电泳检测SWNT/DOX/DOTAP/siRNA联合制剂中载体对siRNA的包封情况

3．4 SWNT载药系统的透射电镜图

3．5 研究载体系统及接载药物的体外细胞摄取实验

3．6 流式细胞仪检测细胞摄取率实验

3．7 SRB法检测SWNT/DOX/DOTAP/siRNA联合制剂的细胞毒性研究

3．8 流式细胞仪测定siRNA转染48h后对SGC-7901细胞凋亡的影响

4 讨论

第四章 碳纳米管接载阿霉素复合物在小鼠体内药物动力学及组织分布的初步研究

1 实验材料与仪器

1．1 材料

1．2 仪器

1．3 实验用动物

2 实验方法

2．1 色谱条件

2．2 样品处理

2．3 小鼠血浆和各组织标准曲线的建立

2．4 给药方案

2．5 血浆中药动学数据处理

2．6 组织分布数据处理及靶向性评价

3 数据处理

3．1 检测方法的专属性考察结果

3．2 阿霉素血药浓度标准曲线

3．3 阿霉素体内各组织的标准曲线

3．4 药时曲线及药动学参数的计算

3．5 各时间点的组织分布数据及靶向性评价

4 讨论

第五章 碳纳米管接载阿霉素复合物对裸鼠的体内药效学初步研究

1 实验材料与仪器

1．1 材料

1．2 实验仪器设备

1．3 实验动物及细胞

2 实验方法

2．1 荷瘤裸鼠的模型建立

2．2 分组及给药方案

3 实验结果

3．1 裸鼠肿瘤模型的制备

3．2 裸鼠行为特征与肿瘤及体重变化

3．3 裸鼠肿瘤体积变化

4 讨论

本课题的创新点和不足之处

参考文献

个人简历

致谢