基于纳米金探针和蛋白芯片高灵敏检测肺癌多肿瘤标志物的研究

摘要

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率已跃居常见肿瘤之首，严重危害人类的身体健康。随着医学科学技术的不断发展，肺癌的诊断和治疗水平已得到显著提高，但仍远远不能满足临床和人类的需要。大量研究表明，肺癌的预后与临床分期密切相关，早期肺癌患者的5年生存率可达70％以上，降低肺癌病死率最有效的方法是对其及早诊断和治疗。但肺癌早期多不易发现，大部分肺癌在确诊时已经是中晚期。所以，及早发现、诊断和治疗肺癌有着很大的临床意义。目前在临床上，肺癌早期检查主要依靠影像学，但假阳性率较高，且检查费用贵。因此，对肺部结节的良恶性鉴别是早期肺癌检测中亟待解决的问题。随着蛋白质组学的不断发展，肿瘤标志物检测在肺癌早期诊断及治疗中的价值越来越受到重视。
　　 多项研究表明，在肿瘤早期检测和诊断、临床分期、病理分型、疗效评估、监测及预后判断等方面，肿瘤标志物具有重要的意义。良好的肿瘤标志物应该具有高敏感性、强特异性、检测方便等特点。目前对肺癌来说，还没有高敏感性、强特异性的标志物，单一肿瘤标志物往往检测意义较小，难于全面评估。现在临床上多将多种肿瘤标志物联合进行检测，但多指标联合检测操作比较繁琐，并且灵敏度不够高，不能够满足大面积筛查实现肺癌的早期检测。由于生物芯片技术和纳米技术的日益发展，快速的高灵敏度的多肿瘤标志物联合检测得以实现。
　　 目的:
　　 建立以蛋白芯片和纳米金探针为基础的高灵敏度多肿瘤标志物检测体系，进而实现对肺癌早期诊断。
　　 方法:
　　 1.首先对纳米金进行标记和表征，然后进行纳米金探针的制备和蛋白芯片的制作，从而建立基本的检测体系。
　　 2.通过梯度优化实验对纳米金的最佳蛋白稳定量和纳米金探针添加量进行优化选择，再进行染色方法的筛选和优化，并对待测肿瘤标志物进行特异性分析，最后对温度、时间等实验条件方面进行优化，从而优化检测体系。
　　 3.利用本检测体系检测86例肺癌病人和42例健康体检者，对其检测结果进行分析，绘制四种肿瘤标志物的标准曲线，并与临床所用的电化学分析法及DKK1试剂盒检测结果进行比较，分析检测结果和临床资料参数间的关系。
　　 4.统计学处理:应用SPSS17.0进行统计学分析，采用非参数检验、x2检验及相关性分析。取检验水准α=0.05。
　　 结果:
　　 1.最佳蛋白稳定量在200μL纳米金溶液中CEA为2.0μL(抗体浓度为5mg/mL)CYFRA21-1为5.0μL(抗体浓度为2mg/mL)，NSE为14.0μL(抗体浓度为1.04mg/mL)，DKK1为6.0μL(抗体浓度为2mg/mL)。
　　 2.纳米金在标记检测抗体后发生了红移，最大吸收峰由520nm增大到530nm。
　　 3.纳米金探针的最佳加入浓度为CEA1.0nM，CYFRA21-1为1.4nM，NSE为1.8nM，DKK1为2.0nM。
　　 4.本研究最终选定H2O2法纳米金沉积进行染色，并确定氯金酸的最佳浓度为20mM，H2O2的最佳浓度为3.0M。
　　 5.四种肿瘤标志物在蛋白芯片上无交叉反应和相互干扰，特异性良好。
　　 6.四种肿瘤标志物的标准曲线:在绘制的四种蛋白标准曲线中均有线性关系比较良好的阶段，具体线性分布为CEA（40pg/mL～25ng/mL，R2=0.99）、CYFRA21-1(70pg/mL～25ng/mL,R2=0.994)、NSE(90pg/mL～25ng/mL,R2=0.994)、DKK1(90pg/mL～25ng/mL，R2=0.996)。检测限方法确定了CEA蛋白的灵敏度为10pg/mL，CYFRA21-1为15pg/mL，NSE的灵敏度为20pg/mL，DKK1为30pg/mL。
　　 7.检测结果与临床所用的电化学发光法检及DKK1试剂盒测结果进行相关性分析，显示两种方法检测结果整体一致（相关系数分别为CEA:r=0.986;CYFRA21-1:r=0.985;NSE:r=0.978;DKK1:r=0.993）。四种肿瘤标志物值在肺癌组和健康体检组间的差异具有统计学意义（均P＜0.05），且在肺癌组中的浓度明显高于健康体检组。在健康对照组中，四种肿瘤标志物浓度在不同性别组和不同年龄组（≤60岁和＞60岁）间差别没有统计学意义（均P＞0.05）。在肺癌组，四种肿瘤标志物的值在不同年龄、性别、是否吸烟间差别没有统计学意义（均P＞0.05）。CEA、CYFRA21-1、NSE在不同病理分型中差别有统计学意义（均P＜0.05），而DKK1在不同病理分型中差别无统计学意义(P=0.294)。并且，CEA在腺癌中的浓度最高(P＜0.001)，CYFRA21-1在鳞癌中的浓度最高(P=0.004)，NSE在小细胞癌中的浓度最高(P=0.002)。四种肿瘤标志物在不同临床分期中差别有统计学意义（均P＜0.05），并且Ⅳ期的浓度明显高于其他3个分期（均P＜0.05）。取42例健康体检者四种肿瘤标志物值的95％为各指标的临界值(4.82ng/mLtoCEA，3.04ng/mLtoCYFRA211，23.7ng/mLtoNSE，14.15ng/mLtoDKK1)，肺癌组敏感性CEA为38.37％，CYFRA21-1为51.16％，NSE为26.74％，DKK1为52.33％，四者联合检测为88.37％，比任何单一检测都大大提高（均P＜0.001）。并且，CEA在腺癌中的敏感性最高为54.35％，CYFRA21-1在鳞癌中的敏感性最高为54.84％，NSE在小细胞肺癌中的敏感性最高为66.67％。
　　 结论:
　　 本研究以蛋白芯片和纳米金探针为基础，通过纳米金沉积进行信号放大，构建了一种超微量蛋白质的检测方法，能够半定量的对蛋白进行可视化检测，已能够高灵敏对CEA、CYFRA21-1、NSE和DKK1四种肿瘤标志物在1.5h内进行检测，实现多种肿瘤标志物同时快速检测，达到肺癌早期诊断和评估的目标。并且，由于通过肉眼或普通的显微镜即可对实验结果进行分析，使用仪器非常简单，大大降低了检测成本，具有广泛的应用前景。同时，为临床肿瘤标志物检测和肺癌早期诊断提供了理论和试验基础。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

引言

材料和方法

1 主要试剂

2 主要仪器

3 材料主要溶液配制

4 血清标本及临床资料

5 实验方法

6 统计学处理

7 本研究的反应原理及检测流程图

结果

1 最佳蛋白稳定量的优化

2 纳米金探针的表征

3 纳米金探针加入量的确定

4 染色方法的选择和优化

5 四种肿瘤标志物的特异性分析

6 标准曲线的绘制

7 标本检测情况及分析

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢