ALDH1A2在结肠癌中的表达及对结肠癌细胞生物学的作用

摘要

结肠癌是常见的严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤。目前结肠癌的治疗手段以手术治疗为主，辅以全身或局部放、化疗，但术后肿瘤易复发。提高结肠癌术后生存率和降低死亡率的关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗。深入研究大肠癌相关基因的表达并对其机理进行研究，有利于大肠癌的综合防治。
　　 乙醛脱氢酶家族包含由17个基因翻译成的一组同工酶，可分别催化不同底物，广泛分布于肝、肠等多种组织中。研究结果显示:ALDH1与肿瘤的发生、发展密切相关。ALDH1A2是催化视黄醛氧化成维甲酸的关键酶，维甲酸与维甲酸受体(retinoicacidreceptor，RAR)以及维甲酸X受体（retinoicXreceptora，RXR）通过配体结合区域结合，直接作用于靶基因，调节不同靶基因的表达，进而调控正常和肿瘤细胞的生长和分化。大量研究表明:ATRA可抑制肿瘤细胞生长、浸润、转移及粘附，使肿瘤细胞致瘤性及软琼脂克隆形成能力下降，使胃癌细胞株MKN45H对基底膜胶的粘附能力下降，并显著降低原胶原、纤维结合素及层粘连蛋白的合成，在抑制肿瘤的侵袭、转移过程中起着重要作用，ALDH1A2是体内合成ATRA的关键酶，我们设想ALDH1A2在抑制结肠癌细胞增殖、侵袭转移及粘附过程也将起着重要作用。
　　 基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMPs)是一类具有降解细胞外基质和基底膜能力的蛋白水解酶，在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润、转移中起重要作用，在肿瘤演进等众多生理和病理过程中均发挥着重要的作用。研究发现，在许多肿瘤组织中，都发现有较高MMP2的表达，且其表达程度与肿瘤的侵袭性有关。E-cadherin是介导上皮细胞间粘附的主要粘附分子，主要介导同质性细胞粘附，如瘤细胞与瘤细胞之间的粘附，因此E-cadherin表达减少，有助于肿瘤侵袭转移。
　　 本研究中，我们首先利用免疫组化技术、逆转录-PCR技术及免疫印迹技术测定人结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherinmRNA及蛋白的表达情况;随后利用基因扩增技术获得人ALDH1A2基因cDNA序列，构建pEGFP-N1-ALDH1A2表达载体并转染到人结肠癌细胞株LOVO细胞，获得稳定携带pEGFP-N1-ALDH1A2载体的LOVO，测定转染前后细胞中ALDH1A2mRNA及蛋白的表达，并利用紫外分光技术测定转染前后细胞中ALDH1A2的活性;采用MTT实验、克隆形成实验、Transwell小室侵袭实验、逆转录-PCR技术、免疫荧光技术及免疫印迹技术检测pEGFP-N1-ALDH1A2载体转染后对细胞增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力的影响，并检测侵袭、粘附相关因子的表达，同时用ATRA作为阳性对照;最后为进一步研究ALDH1A2在结肠癌的作用机制，我们利用转染的细胞构建裸鼠移植瘤模型，观察不同裸鼠成瘤时间、瘤体平均体积，平均瘤重的不同，探讨ALDH1A2在体内对结肠癌的影响，以期找到ALDH1A2在结肠癌中的作用机制。本研究分为以下四个部分:
　　 第一部分ALDH1A2在结肠癌中的表达及意义
　　 方法:
　　 1.免疫组化检测52例结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherin蛋白的表达。
　　 2.RT-PCR技术检测20例结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherinmRNA的表达情况。
　　 3.免疫印迹技术检测20例结肠癌及癌旁组织中ALDH1A2、MMP2和E-cadherin蛋白的表达情况。
　　 结果:
　　 1.免疫组织化学、逆转录-PCR及免疫印迹技术结果显示:ALDH1A2、E-cadherin在结肠癌癌旁组织表达高于结肠癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。MMP2在结肠癌组织中表达高于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.ALDH1A2、MMP2及E-cadherin在结肠癌中的表达具有相关性。
　　 第二部分ALDH1A2基因过表达载体构建及鉴定
　　 方法:
　　 1.利用基因扩增技术获得人ALDH1A2基因cDNA序列，经酶切、回收并连接到真核细胞表达载体pEGFP-N1，构建pEGFP-N1-ALDH1A2真核表达载体，并进行酶切及基因测序鉴定。
　　 2.利用脂质体转染技术将pEGFP-N1-ALDH1A2表达载体转染到人结肠癌细胞株LOVO细胞，并利用G418进行筛选。
　　 3.利用逆转录-PCR技术及免疫印迹技术测定转染前后细胞中ALDH1A2mRNA及蛋白的表达。
　　 4.利用紫外分光光度法测定转染前后细胞中ALDH1A2的活性。
　　 结果:
　　 1.酶切及基因测序结果表明成功构建pEGFP-N1-ALDH1A2表达载体
　　 2.转染及G418筛选后，获得稳定携带pEGFP-N1-ALDH1A2载体的LOVO。
　　 3.ALDH1A2mRNA及蛋白在转染pEGFP-N1-ALDH1A2载体的细胞中的表达高于未转染细胞。
　　 4.ALDH1A2活性在转染pEGFP-N1-ALDH1A2载体的细胞中的表达高于未转染细胞。
　　 第三部分ALDH1A2基因过表达对结肠癌细胞生物学功能的影响
　　 方法:
　　 1.MTT法检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组细胞增殖能力的变化。
　　 2.克隆平板形成实验检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组细胞克隆形成能力的变化。
　　 3.Transwell小室侵袭实验检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组细胞侵袭能力的变化。
　　 4.逆转录-PCR法检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组ALDH1A2、MMP2及E-cadherinmRNA含量。
　　 5.免疫荧光法检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组ALDH1A2、MMP2及E-cadherin含量。
　　 6.免疫印迹法检测对照组、空载体组、ALDH1A2组及ATRA组ALDH1A2、MMP2及E-cadherin蛋白的含量。
　　 结果:
　　 1.MTT法检测结果显示ALDH1A2过表达抑制LOVO细胞的增殖。
　　 2.克隆形成实验显示ALDH1A2过表达降低了LOVO细胞克隆形成能力。
　　 3.Transwell小室侵袭实验证实ALDH1A2过表达能够抑制LOVO细胞的侵袭能力。
　　 4.RT-PCR、IF、Wb检测结果显示:与对照组相比，ALDH1A2组ALDH1A2、E-cadherinmRNA及蛋白含量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05);MMP2mRNA及蛋白含量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);ALDH1A2、MMP2及E-cadherinmRNA及蛋白在ATRA组与ALDH1A2组无显著改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 第四部分ALDH1A2基因过表达对移植瘤的影响
　　 方法:
　　 1.利用不同组别的LOVO细胞接种裸鼠构建移植瘤模型，观察不同组别裸鼠成瘤时间、瘤体平均体积，平均瘤重的改变。
　　 2.免疫组化法测定各组裸鼠瘤体组织ALDH1A2、MMP2、E-cadherin的表达。
　　 结果:
　　 1.成功构建LOVO细胞裸鼠移植瘤裸鼠模型，ALDH1A2组及ATRA组裸鼠成瘤时间较对照组明显延长，差异有统计学意义(P＜0.05)，ATRA组瘤重也较对照组明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　 2.与对照组相比，ALDH1A2组裸鼠中ALDH1A2、E-cadherin含量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05);MMP2含量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05);ALDH1A2、MMP2及E-cadherin在ATRA组与ALDH1A2组无显著改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 结论:
　　 1.人结肠癌组织中ALDH1A2、E-cadherin表达低于癌旁组织，MMP2表达高于癌旁组织，ALDH1A2、MMP2及E-cadherin三者密切相关。
　　 2.成功构建并鉴定了ALDH1A2基因过表达真核表达载体，并获得稳定过表达ALDH1A2的LOVO细胞。
　　 3.ALDH1A2过表达具有抑制结肠癌细胞增殖、克隆形成、侵袭的作用，这种抑制作用可能于ALDH1A2的过表达，以及E-cadherin的高表达及MMP2的低表达相关。
　　 4.成功地建立了人结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型，ALDH1A2过表达组裸鼠成瘤时间短、瘤重低，裸鼠组织中ALDH1A2、E-cadherin高表达，MMP2低表达。
　　 5.ALDH1A2可以通过调节MMP2及E-cadherin的表达，抑制结肠癌细胞生长、增殖、侵袭转移及粘附的作用

目录

声明

摘要

中英文缩写索引

前言

第一部分 ALDH1A2在结肠癌中的表达及意义

前言

材料及方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 ALDH1A2基因过表达载体构建及鉴定

前言

材料及方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 ALDH1A2基因过表达对结肠癌细胞生物学功能的影响

前言

材料及方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分 ALDH1A2基因过表达对移植瘤的影响

前言

材料及方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文结论

综述

个人简历及读博期间发表的论文

致谢