VEGF-165与Matrigel基底膜基质模拟神经新生微环境对海马神经干细胞的作用

摘要

目的：
　　神经干细胞移植为中枢神经系统损伤提供了新的治疗途径，但近年来研究发现，外源性神经干细胞移植存在着神经于细胞存活率低，向神经元分化较少等问题。而血管-神经新生的概念以及神经新生微环境的提出为解决这些问题提供了新的方向。本次实验通过新生大鼠提取神经干细胞体外培养为基础，探讨VEGF-165与Matrigel基底膜基质模拟神经新生微环境对神经干细胞生长、分化的作用。
　　研究方法：
　　本次研究以新生24小时内的SD大鼠为神经干细胞供体，通过提取海马组织中神经干细胞进行体外培养，并以巢蛋白nestin免疫组化染色进行鉴定。将培养成功的神经干细胞分别接种于多聚赖氨酸包被的24孔板和Matrigel基底膜基质中，并分别给予正常神经干细胞培养基，胎牛血清诱导分化培养基，VEGF-165诱导分化培养基和VEGF+血清诱导分化培养基进行培养、诱导分化，诱导分化一周后通过免疫荧光染色法，对诱导后的细胞进行nestin蛋白、β-tubulinⅢ蛋白和GFAP蛋白检测，观察各诱导组的三种蛋白阳性细胞比例，并对比Matrigel基底膜基质应用前后的细胞分化情况，以明确VEGF-165和Matrigel基底膜基质的应用以及两者联合作用对于神经干细胞生长分化的影响。
　　结果：
　　1.神经干细胞培养:经新生大鼠海马组织进行神经干细胞提取，经体外培养1周后形成约几百细胞形成的细胞球，经胰酶与机械分离法结合将细胞球吹散以进行传代，传代后细胞生长良好，可稳定传代。行nestin免疫组化染色后，培养所的细胞球绝大多数染色呈强阳性反应。因此，经新生大鼠海马区提取培养所得的细胞是神经干细胞。
　　2.VEGF-165诱导分化:通过不同的培养基配置方案诱导神经干细胞的生长与分化，可以得出VEGF-165对于神经干细胞生长分化的大致作用，即促VEGF-165在神经干细胞的增殖与分化中可起调控作用，能促进NSCs的增殖与分化，并可能存在诱导NSCs向神经元方向分化作用。因此，血管内皮生长因子(VEGF)可能是神经干细胞增殖与分化的促进因素，对于研究神经干细胞生成及分化具有重要意义。
　　3.Matrigel基底膜基质与VEGF-165联合作用:Matrigel基底膜基质可以为神经干细胞增殖与分化提供理想的三维立体培养环境，并能促进神经干细胞的分化，与VEGF-165联合应用可以提高神经元的分化比例，且使细胞间形成更近似于在体组织的结构，对于神经再生有着重要意义。
　　结论：
　　利用血管内皮生长因子(VEGF-165)和Matrigel基底膜基质共同模拟神经新生的微环境，观察神经干细胞在其中的生长及分化情况，并通过设立不同的对照组以及免疫荧光染色的方法对神经干细胞生长和分化情况进行评估，可以推断出血管内皮生长因子(VEGF-165)和Matrigel基底膜基质能够促进神经干细胞的增殖和分化，并且有一定促进神经干细胞向神经元分化的作用。

目录

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摘要

附图目录

附表目录

英文缩写对照表

1．引言

2．新生大鼠海马NSCs的培养及鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要实验仪器及试剂

2．1．3 主要培养基配制

2．2 NSCs的原代与传代培养

2．2．1 NSCs的原代培养

2．2．2 NSCs的传代培养

2．3 NsCs的免疫组化鉴定

2．3．1 NSCs接种与固定

2．3．2 NSCs免疫组化染色

2．4 NSCs培养与鉴定结果

2．4．1 NSCs培养结果

2．4．2 NSCs免疫组化染色结果

2．5 讨论

2．6 小结

3．VEGF-165诱导分化NSCs

3．1 实验材料

3．1．1 主要实验仪器

3．1．2 主要实验试剂

3．1．3 主要培养基配制

3．2 NSCs诱导分化

3．2．1 NSCs诱导分化培养

3．2．2 NSCs诱导分化后免疫荧光染色

3．3 诱导分化结果

3．3．1 NSCs诱导分化后形态学改变

3．3．2 NSCs诱导分化后免疫荧光染色结果

3．4 讨论

3．5 小结

4．诱导分化后NSCs在Matrigel基底膜基质中的生长

4．1 实验材料

4．1．1 主要实验仪器

4．1．2 主要实验试剂

4．1．3 主要培养基配制

4．2 Matrigel基底膜基质三维立体培养

4．2．1 Matrigel基底膜基质三维立体培养及分组

4．2．2 Matrigel基底膜基质的分装与包被

4．2．3 Matrigel基底膜基质中神经干细胞的接种与培养

4．3 神经干细胞三维立体培养后免疫荧光染色

4．3．1 免疫荧光染色前准备

4．3．2 免疫荧光染色步骤

4．4 神经干细胞在Matrigel基底膜基质中生长分化结果

4．4．1 神经干细胞在Matrigel基底膜基质三维立体培养结果

4．4．2 巢蛋白Nestin免疫荧光染色结果

4．4．3 β-tubulinⅢ蛋白和GFAP蛋白免疫荧光双重染色结果

4．5 讨论

4．6 小结

5．结论

参考文献

综述 神经干细胞对组织修复的新进展

自我介绍

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