ARID2基因在原发性肝细胞癌中的异常表达及影响因素

摘要

背景：
　　 原发性肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是最常见的肝癌类型，也是最常见的消化系统恶性肿瘤之一[1，2]。2011年中国新发肝癌人数占全球人数一半以上，严重威胁人民群众的健康。HCC的发生和发展是一个多因素、多阶段累积的复杂过程，主要危险因素包括酗酒、病毒感染及黄曲霉毒素，不同国家和地区的危险因素有较大差异[3-5]。针对HCC，目前缺乏有效的治疗措施且易复发，其具体的分子作用机制研究尚未明确，需进一步研究[6]。目前认为，抑癌基因的功能缺失和致癌基因的激活与HCC发生密切相关[7]。相关报道显示ARID2基因的功能异常与原发性肝癌的发生发展可能相关[12]。但ARID2基因在原发性肝癌中发挥的重要作用还需进一步研究。
　　 目的：
　　 检测ARID2基因在肝癌细胞系和原发性肝癌组织中的表达水平及其异常表达的影响因素，初步探讨其表达水平与临床病理资料的相关性及其在原发性肝癌发生发展过程中发挥的重要作用，为原发性肝癌的早期诊断和治疗提供依据。
　　 方法：
　　 选取2009年5月至2010年4月在河南省肿瘤医院进行HCC手术切除患者105例。收集患者临床指标和膳食营养物质摄入水平调查结果。所有患者均经病理学检验确认，且术前未接受放化疗。9株肝癌细胞系由北京大学医学部基础医学院病原生物学教研室提供。应用荧光定量PCR方法测定肝癌细胞系、组织样本中ARID2基因mRNA表达水平，CTBP作为内参基因。从启动子区甲基化状态、组蛋白去乙酰化程度及microRNA的调控三方面探讨影响ARID2基因表达的因素。检测经5-aza-dC、TSA试剂及联合处理的三种细胞系中ARID2基因的表达水平。分析23例HBV感染背景的样本中miR155和ARID2基因的表达水平相关性。对76例HBV感染背景的样本中ARID2基因的表达水平和临床指标、膳食因素进行相关性分析。
　　 结果：
　　 4个无HBV感染背景的肝癌细胞系:Huh7、SK-HEP-1和SMMC7721细胞系中目的基因表达水平上调;5个HBV感染背景的细胞系:仅在SNU449细胞系中表达水平上调，SNU387、Hep3B和SNU182细胞系中表达水平下调。ARID2基因在癌及癌旁组织中的表达水平与正常肝组织相比均显著下调。无HBV感染背景的组织中ARID2基因在癌组织中的表达水平显著高于其在癌旁组织中的表达水平(P=0.0395)。ARID2基因在不同感染背景下的癌组织和配对癌旁组织中表达水平的分布频率有显著性差异(P=0.0002)。
　　 去甲基化和乙酰化处理后的细胞系中ARID2基因的表达水平均有不同程度上调。miR155和ARID2基因的表达水平呈负相关（r=-0.46652，P=0.0248）。异常表达主要见于高年龄组、AFP＜400和临床Ⅰ-Ⅱ期的患者;同时主要见于食盐摄入量较多和豆类及豆制品、茶类饮品摄入较少的患者。
　　 结论：
　　 ARID2基因在肝癌组织和肝癌细胞系中存在异常表达。启动子区甲基化状态、乙酰化程度和miR155的调节作用可能是ARID2基因异常表达的影响因素。ARID2基因在肝癌组织中的异常表达可能与临床指标及膳食营养物质摄入水平相关。

目录

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摘要

图表目录

英文缩略词表

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 实验对象的选择和临床标本的采集

2．2．2 临床指标和膳食调查数据收集

2．3 miR155表达水平检测样本来源

2．4 肝癌细胞系的来源及培养

2．5 肝癌细胞系及HCC患者配对癌组织及癌旁组织中总RNA的提取

2．5．1 准备阶段——台面整理及RNA提取专用试剂的准备

2．5．2 详细提取操作步骤(全部操作过程均需在冰上经行)

2．6 总RNA提取质量检测

2．6．1 紫外分光光度法测定RNA浓度及OD值

2．6．2 琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的质量

2．7 逆转录实验操作

2．7．1 逆转录详细操作步骤

2．7．2 扩增内参基因GAPDH检测cDNA质量

2．8 荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)检测ARID2基因相对表达水平

2．8．1 扩增CTBP基因为内参基因

2．8．2 Real-time PCR相对定量检测样本cDNA中ARID2基因的含量

2．8．3 ARID2基因、CTBP基因及GAPDH基因引物序列

2．8．4 质量控制

2．9 细胞系经5-aza-dC和TSA试剂处理实验步骤

2．9．1 实验前准备工作

2．9．2 铺板

2．9．3 加药

2．9．4 定量检测

2．10 5-aza-dC和TSA试剂处理

2．11 miR155在配对肝癌组织和癌旁组织中表达水平检测

2．12 统计学分析

3 实验结果

3．1 ARID2基因在肝癌细胞系和HCC患者配对组织中的表达水平

3．1．1 研究对象的基本情况

3．1．2 ARID2基因在肝癌细胞系中的表达水平

3．1．3 ARID2基因在HCC组织中的表达水平

3．1．4 不同感染背景下HCC组织中ARID2基因表达水平

3．2 ARID2基因在肝癌细胞系和HCC配对组织中表达水平的影响因素探讨

3．2．1 启动子区CpG岛甲基化状态及组蛋白去乙酰化程度对ARID2基因表达水平的影响

3．2．2 miR155与ARID2表达水平的相关性

3．3 ARID2基因表达水平与临床指标及膳食因素的相关性

3．3．1 研究对象的基本情况

3．3．2 ARID2基因表达水平与临床指标的相关性

3．3．3 ARID2基因表达水平与膳食营养物质摄入水平的相关性

4 讨论

4．1 ARID2基因在肝癌细胞系和HCC配对组织中表达水平分析

4．2 启动子区甲基化状态、乙酰化程度和microRNA对基因表达水平的影响

4．3 启动子区甲基化状态、乙酰化程度和miR155对ARID2基因表达水平的影响

4．4 乙型肝炎病毒感染与原发性肝癌的相关性

4．5 原发性肝癌与临床资料信息的相关性

4．7 ARID2基因表达水平与膳食营养物质摄入水平的相关性

5．结论

参考文献

综述

个人简历

致谢