诱导多能干细胞移植促进脑出血模型大鼠神经功能恢复并减少神经细胞凋亡

摘要

脑出血(Intracerebralhemorrhage，ICH)是一种严重威胁人类健康的重大疾病，其病死率和致残率均比较高，预后常遗留有严重的神经功能障碍。如何能够更好地使受损伤的各种神经功能，得到及时有效的恢复和改善，是一个十分紧迫的现实问题，也是一个世界性的难题。
　　 诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)具有自我更新、多向分化和细胞再生的能力，它能分化为神经元及神经胶质细胞等衍生细胞，成为细胞移植治疗ICH的一个重要的选择。iPSCs的出现成功地绕开了胚胎干细胞的免疫原性和伦理性两个最关键的问题，并能解决神经干细胞种子细胞来源不足的问题。患者自体的iPSCs移植的临床前研究，将极大促进自体iPSCs移植技术和方法的临床应用的可行性。
　　 细胞凋亡在很大程度上对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinylaspartate-specificprotease，caspase)家族的酶的活化具有依赖性，而caspase-3这种酶是哺乳动物细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶。大量的研究证实了caspase-3在多种脑损伤的病理变化中起了极其重要的作用，其中包括脑梗塞、脑外伤、癫痫等各种神经系统疾病，它是有效参与神经细胞凋亡的效应因子。移植的iPSCs是否通过下调caspase-3的表达量和减少神经细胞凋亡起到促进神经功能恢复的作用，尚有待于进一步研究。
　　 本实验采用立体定向纹状体注入胶原酶法制作大鼠ICH模型，随后将iPSCs移植入ICH模型大鼠脑内。通过TUNEL法进行凋亡细胞计数及观察caspase-3表达的变化，从抗凋亡的角度，探讨ICH患者来源的iPSCs移植改善ICH大鼠神经功能恢复的可能机理，为促进iPSCs的临床应用提供更多的理论依据和实验支持。
　　 目的：
　　 初步探讨iPSCs移植对ICH模型大鼠神经功能恢复，血肿周围细胞凋亡数变化和caspase-3表达的影响。
　　 方法：
　　 1.采用立体定位仪在大鼠的右侧纹状体注入Ⅶ型胶原酶的方法法制作ICH大鼠模型。选择体重在200-250g的SD雄性大鼠，随机分为假手术组（只进行穿刺不注入Ⅶ型胶原酶）、ICH模型组（在造模后24h-48h内立体定位注射10ulPBS液）及iPSCs移植组（在造模后24h-48h内立体定位注射1×105/只的iPSCs悬液）。
　　 2.采用免疫荧光brdu示踪标记观察移植的iPSCs细胞在大鼠体内存活、迁移情况;
　　 3.采用mNSS(modifiedNeurologicalSeverityScores)评分来定量评价iPSCs移植治疗ICH后的第1、3、7、14、28天神经功能的动态变化;
　　 4.TUNEL染色法研究血肿周围细胞凋亡变化，免疫组织化学及westernblot法检测caspase-3的表达情况。
　　 结果：
　　 1.假手术组在术后1d、3d、7d、14d、28d各个时间点内均未出现明显的神经功能缺损症状，ICH模型组及iPSCs移植组的大鼠在术后24h内即出现神经功能缺损症状并且达到高峰，并且这种神经缺损的症状的高峰期可持续三天，此后随时间的推移大鼠的神经缺损症状逐渐恢复，在第七天时可见庄其神经缺损恢复较明显，在第14、28天时其神经缺损症状有更进一步的恢复，iPSCs移植组的mNSS评分在第14d、28d较ICH模型组显著降低，其差异具有统计学意义(P＜0.05);
　　 2.IPSCs在ICH大鼠脑内可以存活，并向ICH血肿区迁移。
　　 3.移植治疗后iPSCs移植组较大鼠ICH模型组细胞凋亡数减少(p＜0.05);iPSCs移植组血肿周围caspase-3的表达在术后28d较ICH模型组明显减少，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 结论：
　　 1.移植iPSCs能够显著促进ICH大鼠神经功能的恢复。
　　 2.IPSCs在ICH大鼠脑内可以存活，向脑血肿区迁移。
　　 3.IPSCs移植组较ICH模型组血肿周围凋亡细胞明显减少。
　　 4.IPSCs移植能显著下调caspase-3的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料和仪器

2．2 实验方法

3 结果

3．1 iPSCs的培养和鉴定

3．2 大鼠的神经功能评分

3．3 Brdu的免疫荧光染色

3．4 HE染色结果

3．5 TUNEL荧光染色法检测凋亡细胞

3．6 caspase-3免疫组织化学染色结果

3．7 结果分析

3．8 Western blot

4 讨论

4．1 干细胞治疗ICH的模型及移植方法的选择

4．2 ICH患者特异的iPSCs

4．3 脑出血中细胞凋亡与caspase-3的表达

4．4 本研究的意义

5 结论

参考文献

综述

个人简历

在学期间发表的学术论文

致谢