二氧化铈纳米颗粒对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

摘要

1、研究背景和目的：
　　目前，随着我国经济发展和人民生活水平的不断提高，缺血性心脏疾病的发生率和由此引发的死亡率正不断上升。各种临床治疗手段的不断更新发展，为此类疾病提供了更多更有效的治疗方法，但同时心肌缺血再灌注损伤(Myocardium ischemic reperfusion injury，MIRI)在患者病情的恢复中起到的不利影响也逐渐突显了出来。心肌缺血再灌注损伤表现为当心肌细胞经过一段时间的缺血期，血流供应恢复之后，心肌细胞的损伤并没有减轻或者恢复，反而出现了较再灌注以前更加严重的损伤的现象。如何有效的防治缺血再灌注损伤对心肌细胞造成的损害成为有关医学研究的一个热点，相关的研究有如β-受体阻滞剂，钙离子拮抗剂，肾素血管紧张素抑制剂等，但效果却都不是十分的理想。因此，寻找到一种切实而有效的方法或药物来治疗或者改善缺血再灌注损伤成为临床上一个亟待解决的问题。
　　心肌缺血再灌注损伤的发生机制十分复杂。细胞凋亡被认为是其重要的发生机制之一。凋亡又称为细胞的程序性死亡，再灌注后心肌梗死面积扩大即认为是细胞凋亡引起的。缺血再灌注过程中的细胞凋亡可能是由氧自由基(oxygen free radicals，OFR)的大规模爆发性产生、细胞内的钙超载、线粒体损伤等几个原因引起的，其中氧自由基的大量产生被认为是最主要的原因之一。在心肌的缺血再灌注过程中，氧自由基起到了至关重要的作用。心肌缺血再灌注后出现的心律失常、心肌梗死面积扩大等现象均是由于大量爆发性产生的氧自由基引起的。缺血再灌注过程中，大量产生的氧自由基对细胞结构进行了破坏，其与细胞膜磷脂中含量较多的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使细胞膜上的离子通道、酶等膜蛋白的活性降低，从而影响了细胞膜及细胞器膜的功能，使其完整性遭到破坏，流动性降低。
　　我国的稀土资源丰富，二氧化铈作为一种稀土材料被广泛的应用于各个领域。纳米材料因其自身尺度的原因而具有特殊的物理化学性质，针对纳米材料的研究也日渐深入。二氧化铈纳米颗粒(CeO2 nanoparticles)作为一种纳米材料，在近些年来被应用于工业、汽车制造业及人民日常生活中的多个方面。有研究证实，二氧化铈纳米颗粒具有能够清除氧自由基，减弱有机体的氧化应激反应等很强的生物活性。
　　本研究旨在观察二氧化铈纳米颗粒对大鼠缺血再灌注损伤心肌组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和细胞凋亡(apoptosis)的影响，从而探讨其对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用，为对缺血再灌注损伤提供更多的防治手段。
　　2、材料和方法：
　　2.1、二氧化铈纳米颗粒悬液的制备:分别将不同纳米粒径的二氧化铈纳米颗粒溶解在PBS缓冲液(PH7.4，0.01mM)中，并使其充分混匀，注射前，再将其放入超声细胞破碎仪中，进行超声震荡2min的操作，使悬液再次充分混合均匀，完成后再用0.2μm的针头过滤器过滤方可使用。
　　2.2、实验动物分组:健康雄性SD大鼠50只，体重在250～300g之间，随机分成5组，假手术(sham)组、模型(I/R)组、1-10nm粒径组、10-25nm粒径组、50nm粒径组，每组10只。适应性饲养一周后进行模型的制作。大鼠采用10％水合氯醛(300mg/kg)进行腹腔注射麻醉，仰卧位固定牢固，分离气管行气管插管，开胸时连接呼吸机。小动物呼吸机潮气量设定为3ml/100g，呼吸频率为70次/分，呼吸比2∶1。在大鼠胸骨左缘心脏搏动最为明显处切开皮肤，自第4、5肋间进胸，撕破心包膜，充分暴露心脏。于肺动脉圆锥与左心耳之间距离主动脉根部约3～4mm处穿线，在结扎线和心脏表面垫一带有凹槽的乳胶管，待心律规整后结扎左冠状动脉前降支（left anterior decreased coronary artery，LAD），结扎线远端心肌颜色先变白后变为紫绀证明结扎成功。结扎45min后松解结扎线，再灌注120min，缺血部位心肌颜色恢复为模型制作成功。假手术组于术前24h尾静脉注射PBS缓冲液(0.2ml/100g)，左冠状动脉前降支只穿线不结扎;模型组于术前24h经尾静脉注射PBS缓冲液(0.2ml/100g)，左冠状动脉前降支结扎45min，松解120min，成功制作缺血再灌注模型;三种不同纳米粒径组均于术前24h经尾静脉注射各自粒径Ce02纳米悬液(0.2ml/100g)，模型制作同模型组。
　　2.3、心肌再灌注120min后处死大鼠，迅速取出心脏，冷生理盐水充分冲洗至无血液残留，取左心室缺血区心肌组织，分为两部分，一部分迅速用滤纸吸干水分后转移至-80℃冰箱中保存待用，另外一部分置于甲醛溶液中固定，用于组织病理学观察和细胞凋亡的检测。将-80℃冰箱中保存的新鲜心肌组织在低温环境下制备心肌组织匀浆，应用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，比色法测定GSH-Px活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。将甲醛溶液中固定的部分大鼠心肌组织制备常规石蜡切片，用于苏木素-伊红染色（HE染色）、细胞凋亡的检测。
　　2.4、统计各组数据，所有数据均以均数±标准差（(x)±s）表示，各组数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，应用SPSS17.0统计分析软件进行分析，检验水准α取0.05，P＜0.05认为有统计学意义。
　　3、结果：
　　3.1、模型组大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px活性比假手术组明显降低，组间差异显著(P＜0.05)，差异具有统计学意义;三组不同粒径二氧化铈纳米组心肌组织中SOD、GSH-Px活性比模型组明显升高(P＜0.05)，差异具有统计学意义;三组不同粒径二氧化铈纳米颗粒组之间相比，10-25nm粒径组SOD、GSH-Px活性明显高于另外两组(P＜0.05)，差异具有统计学意义，1-10nm粒径组与50nm粒径组比较，SOD、GSH-Px活性明显升高(P＜0.05)，差异具有统计学意义。
　　3.2、模型组大鼠心肌组织中MDA含量比假手术组明显升高（P＜0.05），差异具有统计学意义;三组不同粒径二氧化铈纳米颗粒组心肌组织中MDA含量比模型组明显降低(P＜0.05)，差异具有统计学意义;三组不同粒径二氧化铈纳米颗粒组之间相比，10-25nm粒径组MDA含量明显低于另外两组(P＜0.05)，差异具有统计学意义，1-10nm粒径组与50nm粒径组比较，MDA含量明显降低(P＜0.05)，差异具有统计学意义。
　　3.3、大鼠心肌组织病理学显示，假手术组较模型组心肌细胞结构完整，三种不同粒径二氧化铈纳米颗粒组和模型组比较细胞形态有明显的改善，但仍然不如假手术组，存在炎症细胞浸润等现象。
　　3.4、心肌细胞凋亡检测结果显示，模型组心肌细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)较假手术组显著升高(P＜0.05)，差异具有统计学意义;三种不同粒径二氧化铈纳米颗粒组AI均明显低于模型组(P＜0.05)，差异具有统计学意义，其中10-25nm组AI明显低于另外两组(P＜0.05)，差异具有统计学意义，1-10nm组、50nm组两组之间无显著差异(P＞0.05)。
　　4、结论：
　　4.1、二氧化铈纳米颗粒可显著提高大鼠缺血再灌注损伤心肌组织中SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量。
　　4.2、二氧化铈纳米颗粒明显降低了心肌细胞凋亡的发生，改善了再灌注损伤引起的心肌细胞的形态改变。
　　4.3、减轻了大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤过程中的氧化应激，对大鼠心肌细胞起到了一定程度的保护作用。

目录

声明

摘要

缩略词索引

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述 缺血再灌注损伤的研究进展

个人简历

攻读硕士学位期间发表文章情况

致谢