DYC-279对人肝癌细胞株HepG-2体外抗肿瘤活性的初步研究

摘要

1、背景和目的:
　　1，2，3-三氮唑在药物化学合成中占据重要地位，它具有易于合成以及生物活性较高等特点。近年研究表明，1，2，3-三氮唑类化合物具有较强的抗肿瘤活性，使此类化合物的研究成为研发抗肿瘤药物的一个热点。DYC-279是一种新合成的小分子化合物，具有1，2，3-三氮唑基团的二硫代氨基乙酸酯，相对分子质量为468，对MGC-803、MCF-7、PC-3和EC-109等细胞株具有较强的抑制作用，是一种具有活性的药物前体，但其作用机制尚没有明确的报道。本文研究了DYC-279对人肝癌细胞HepG-2的体外抗肿瘤活性，运用Western blot及PCR方法探讨其干扰细胞周期及诱导凋亡作用的机制，并初步考察了DYC-279对CYP450酶活性的影响。
　　2、方法:
　　分别用0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5mg/L的DYC-279处理人肝癌HepG-2细胞24、48及72h后，CCK-8法检测DYC-279对细胞的增殖抑制作用;用浓度为0.78、1.56、3.13mg/L的DYC-279处理人肝癌HepG-2细胞24h后，FCM检测细胞周期变化和凋亡情况;使用RT-PCR及Western blot技术检测细胞周期及凋亡相关因子CyclinB1、cdc-2、CyclinD1、Caspase9、Bax及Bcl-2的mRNA或蛋白表达水平变化;使用大鼠S9体外孵育体系，分析DYC-279对CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1三种代谢酶活性的影响。
　　3、结果:
　　(1)DYC-279对细胞株HepG-2的抑制实验
　　CCK-8法检测结果表明DYC-279对细胞的抑制作用随药物浓度的增大而增大，随药物作用时间的延长而增加;DYC-279处理细胞24h、48h及72h后，DYC-279对人肝癌细胞株HepG-2的IC50值分别为（10.6±2.7）mg/L、（6.5±1.9）mg/L、（3.1±1.1）mg/L。
　　(2)DYC-279对HepG-2细胞周期及凋亡的干扰作用
　　FCM检测细胞周期变化显示，随着药物浓度的增加，处于G0/G1期的细胞数目减少，G2/M期的明显增加，而S期细胞数目变化不明显。使用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡显示，药物作用24h后，细胞早期凋亡及晚期凋亡数目有增加的趋势，且早期凋亡更加明显。
　　(3)PCR技术检测周期相关基因表达的变化
　　PCR检测CyclinB1、cdc-2、CyclinD1基因的mRNA水平结果显示，CyclinB1、cdc-2基因的mRNA表达水平均上调，CyelinD1基因的mRNA水平显著下调，预示着细胞周期相关基因CyclinB1、cdc-2、CyclinD1的表达受到DYC-279的影响。
　　(4)DYC-279对细胞周期及凋亡相关蛋白表达的影响
　　实验采用Western blot方法检测周期蛋白CyclinB1、cdc-2、CyclinD1及凋亡蛋白Caspase9、Bcl-2、Bax的表达水平。实验表明蛋白CyclinB1、cdc-2、Caspase9、Bax等的表达水平随用药浓度的增加而上调，蛋白CyclinD1与Bcl-2的表达水平明显下调。
　　(5)DYC-279对CYP450酶活性的影响
　　不同浓度DYC-279与S9孵育体系中，与对照组相比，非那西丁的浓度变化不明显，表明DYC-279对CYP1A2酶活性无影响;右美沙芬的代谢减慢，说明了DYC-279降低了CYP2D6的活性;氯唑沙宗的代谢减慢较快，说明了DYC-279同样降低了CYP2E1的活性，同时孵育体系中DYC-279的浓度越高，氯唑沙宗的代谢越慢，预示着DYC-279对CYP2E1活性的影响可能具有浓度依赖性。
　　结论:
　　(1)DYC-279在一定浓度下抑制人肝癌HepG-2细胞株的增殖。
　　(2)DYC-279阻滞HepG-2细胞于G2/M期并诱导其凋亡现象的产生。
　　(3)DYC-279的抗肿瘤活性可能与CyclinB1、cdc-2、CyclinD1、Caspase9、Bcl-2、Bax等蛋白表达异常相关。
　　(4)DYC-279可以抑制代谢酶CYP2D6及CYP2E1的活性而对CYP1A2的活性影响不大。

目录

声明

摘要

前言

第1章 DYC-279对人肝癌细胞株HepG-2体外抑制实验

1 仪器与试剂

1．1 细胞株

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 溶液的配制

2 实验方法

2．1 细胞培养基本方法

2．2 CCK-8法检测DYC-279对细胞株HepG-2的体外抑制作用

2．3 DYC-279对HepG-2细胞形态的作用

2．4 细胞周期检测

2．5 细胞凋亡检测

2．6 统计分析

3 实验结果

3．1 CCK-8法对DYC-279体外抗肿瘤活性测定

3．2 DYC-279影响细胞HepG-2形态

3：3 DYC-279阻滞细胞于G2／M期

3．4 DYC-279在HepG-2细胞系中引起凋亡

4 讨论

5 本章小结

第2章 DYC-279对周期调控相关基因表达情况的研究

1 仪器和材料

1．1 仪器与材料

1．2 主要试剂

1．3 溶液的配制

1．4 引物设计与合成

1．5 试剂与器皿的处理

2 实验方法

2．1 实验分组

2．2 总RNA提取

2．3 RNA浓度及纯度测定

2．4 RNA逆转录cDNA

2．5 PCR(Polymerase Chin Reaction，聚合酶链式反应)扩增产物

2．6 琼脂糖凝胶电泳

2．7 统计学分析

3 实验结果

3．1 DYC-279对人肝癌HepG-2细胞CyclinB1，cdc-2和CyclinD1基因转录水平的影响

4 讨论

5 本章小结

第3章 Western blot检测DYC-279对周期相关蛋白及凋亡相关蛋白的影响

1 仪器与材料

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂

1．3 溶液的配制

2 实验方法

2．1 实验分组

2．2 蛋白标准曲线的建立

2．3 细胞蛋白提取及浓度测定

2．4 western blot步骤

2．5 统计学分析

3 实验结果

3．1 DYC-279对周期蛋白的影响

3．2 DYC-279对凋亡蛋白的影响

4 讨论

5 本章小结

第4章 DYC-279对大鼠肝微粒体CYPA2，CYPD6，CYPE1酶活性影响的研究

1 仪器与试剂

1．1 主要仪器

1．2 试剂

1．3 主要试剂的配制

1．4 实验动物

2 实验方法

2．1 S9的制备

2．2 S9体外孵育体系

2．3 DYC-279对大鼠肝微粒体CYP450酶CYP1A1，CYP2D6，CYP2E1活性的影响

3 实验结果

3．1 S9蛋白含量测定

3．2 S9活性的验证

3．3 DYC-279对大鼠肝微粒体CYP1A2，CYP2D6，CYP2E1活性影响

4 讨论

5 本章小结

全文总结

参考文献

综述 1，2，3-三氮唑抗肿瘤药物及抗肿瘤机制的研究

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致谢