兔骨髓间充质干细胞定向成骨诱导复合异种松质骨修复兔尺骨骨缺损的实验研究

摘要

目的：
　　研究经定向成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞复合异种松质骨移植修复兔尺骨骨缺损的能力及特点，为骨组织工程治疗骨缺损选择理想的种子细胞来源及合适的支架材料寻求一种新的方法。
　　方法：
　　先取新生24h内新西兰大白兔颅盖骨，采用改良酶消化法提取兔成骨细胞(osteoblast，0B);再取2周龄新西兰大白兔四肢长骨，采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞(BMSCs)。通过细胞形态学观察、细胞化学染色、MTT法测定细胞增殖等检测，对两种原代细胞进行鉴定。
　　取第3代BMSCs和OB，应用Transwell双层细胞培养板将两种细胞共同培养，实验共设三组:A组上室接种OB，B组和C组上室均未接种细胞，B组使用成骨诱导培养液培养，C组使用BMSCs生长液培养作为空白对照组，三组培养下室均接种BMSCs。通过细胞形态学观察、茜素红染色、BMSCs上清液中碱性磷酸酶和骨钙素测定，RT-PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达，对诱导后的细胞进行鉴定。
　　取检疫合格的猪股骨髁部松质骨，经处理制成生物型异种松质骨。使用前BMSC生长液浸泡6h，晾干后接种定向成骨诱导的BMSCs，体外培养一周，显微镜下观察成骨诱导的BMSCs在异种松质骨支架上的粘附、生长情况，MTT法测定支架上细胞增殖情况。
　　取6月龄新西兰大白兔36只，采用完全随机抽样的方法，抽取30只新西兰大白兔每组15只作为实验组和对照组，其余6只作为空白对照组，随机选取一侧前肢制作尺骨中段15mm节段性骨缺损模型。按照植入物不同分为三组:实验组:缺损处植入成骨诱导的BMSCs复合异种松质骨;对照组:缺损处植入异种松质骨;空白对照组:不植入任何材料。于术后4、8、12周3个时间点每组处死5只实验动物取标本，通过X线检查、标本大体观察和骨缺损区HE组织化学染色，及术后12周兔尺骨缺损区几何参数测量，比较各组骨缺损的修复情况。
　　结果：
　　1.细胞的提取和鉴定:密度梯度离心法提取BMSCs，操作简单、细胞纯度高，得到的细胞呈长梭形;改良酶消化法提取成骨细胞，耗时短、细胞产出率高，得到的细胞呈短梭形或多角形。两种原代细胞经鉴定为骨髓间充质干细胞和成骨细胞。
　　2.BMSCs定向成骨诱导分化:Transwell双层细胞培养板法和成骨诱导液培养法两组细胞上清液中AKP、OCN含量在同时间检测点上检测结果显示两者无明显差异(P＞0.05)，两组成骨诱导后的细胞茜素红染色均为阳性，RT-PCR检测两组成骨诱导的细胞OCN和CollagenⅠ的mRNA均有表达。
　　3.异种松质骨的制备与成骨诱导的BMSCs复合培养:经去抗原处理后的异种松质骨，外观呈白色至淡黄色、疏松多孔状。接种细胞后显微镜下观察细胞在异种松质骨支架材料上生长良好，MTT法测定结果显示随着培养时间增加细胞数量增多。
　　4.骨缺损修复实验:X线观察:术后4、8、12周显示实验组骨缺损区骨痂量明显多于对照组及空白组。X线评分结果:各组均随时间延长得分逐渐增多，实验组与其他各组相比差异均有显著性意义(P＜0.05）。组织学观察:术后4、8、12周实验组形成的编织骨量明显多于对照组和空白组。术后12周标本几何参数测量:实验组尺骨骨痂中分处的冠状径、矢状径和骨痂厚度明显大于对照组和空白组，统计学分析差异有显著性意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.密度梯度离心法提取BMSCs和改良酶消化法提取成骨细胞是较为优良的原代细胞提取方法。
　　2.Transwell双层细胞培养板法能使BMSCs定向诱导为成骨细胞，但不适合大规模应用。
　　3.经检测猪骨组织与成骨诱导的BMSCs组织相容性好，异种骨可作为组织工程骨的支架材料。
　　4.成骨诱导的BMSCs复合异种松质骨具有良好的修复性能，可以成为骨缺损修复的一种新途径。

目录

声明

摘要

符号说明：中英文缩略词说明

引言

材料与方法

1 材料与仪器

2 实验方法

结果

1 骨髓间充质干细胞和成骨细胞的提取、原代培养与鉴定

2 骨髓间充质干细胞定向成骨诱导分化的鉴定

3 异种松质骨与成骨诱导的BMSCs相容性研究结果

4 组织工程骨修复骨缺损的研究

讨论

1 骨髓间充质干细胞(BMSCs)和成骨细胞的提取和培养

2 骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化

3 异种骨支架材料的制备及组织相容性研究

4 动物模型的有效性

5 不足与展望

结论

附图

参考文献

综述 骨组织工程中种子细胞的应用及研究进展

个人简历

致谢