1,25-(OH)2D3对哮喘小鼠肺内HMGB1及TLR4表达的影响

摘要

支气管哮喘（简称为哮喘）是在儿童时期发病率偏高的一种的呼吸系统慢性炎症性疾病，多种炎症细胞、呼吸道结构细胞和细胞组分均可参与哮喘发病的慢性炎症过程。呼吸道慢性炎症、气道高反应、气道结构重构一直被看作是哮喘发病过程基本的三大病理特征，其中气道慢性炎症一直被视为最基本的病理变化，并决定气道高反应性及气道重塑的严重程度。哮喘的发病机制至今仍未完全弄清楚，至今经过大量试验研究显示:机体自身免疫紊乱与哮喘的发生关系密切，目前关于哮喘免疫紊乱研究的主要方向在Th1/Th2免疫失衡所引起的一系列不正常免疫应答，但至今哮喘Th1/Th2免疫失衡的具体机制尚未清楚。近年来儿童哮喘的发病率及死亡率逐年提高，严重影响儿童的健康和生活质量。高迁移率蛋白B1(HMGB1)是普遍存在的并且高度保守的一种核蛋白，由树突状细胞(DC)、炎症细胞、垂体细胞等在炎症因子的作用下活化后主动释放，病理损伤过程中的坏死细胞也可释放。HMGB1作为免疫调节因子的一种，其释放至细胞外会导致免疫系统发生炎症反应，免疫细胞受到HMGB1的刺激后则可以产生一定的应激反应。HMGB1作为晚期炎症因子，不但参与多种促炎细胞趋化、血管黏附分子、细胞因子等彼此互相作用引起的炎症反应，还参与信号转导途经。在信号转导的机制中研究证实:HMGB1可与其受体toll样受体4(TLR4)相互作用，通过激活核转录因子(NF-κB)，引起下游炎症介质释放。1，25(OH)2D3是维生素D3(VitD3)在体内经修饰活化后形成的，与存在于细胞内的维生素D受体（vitamin Dreceptor，VDR)联结后发挥经典的调节体内钙、磷代谢作用，并在影响细胞增殖、分化方向和调节机体免疫功能等方面发挥极其重要作用。研究显示:1，25(OH)2D3是一种免疫调节剂，其调节免疫的作用主要是通过调节单核细胞及树突状细胞的活性来实现。它对淋巴细胞的增殖、分化发育、细胞周期的进程、细胞因子的产生也存在广泛影响。
　　目前在流行病学调查中证实:1，25-(OH)2D3在可影响哮喘的发病过程，但其影响哮喘发病的详细的作用途经仍不清楚。本次试验方法是:通过应用卵清蛋白致敏和雾化激发制作哮喘小鼠模型，应用1，25-(OH)2D3腹腔注射为干预方法，应用计算机图像分析系统在显微镜下观察各组小鼠气道重塑程度的变化，以及应用PCR及免疫组化方法从RNA水平及蛋白水平观察哮喘小鼠肺组织内HMGB1及TLR4表达量的改变，从而深入研究哮喘的发病机制，为治疗哮喘提供副作用小并且有效的治疗方法。
　　试验目的：
　　通过应用卵清蛋白致敏和雾化激发制作哮喘小鼠气道重塑模型成功后，应用1，25-(OH)2D3腹腔注射为干预方法，在光学显微镜高倍镜视野(10×40)下应用计算机病理图像分析系统观察各组小鼠气道重塑程度的变化，以及应用PCR及免疫组化方法从RNA水平及蛋白水平观察哮喘小鼠肺组织内HMGB1及TLR4表达量的改变，从而深入研究哮喘的发病机制，为治疗哮喘提供副作用小及有效的治疗方法。
　　试验材料和方法：
　　1.实验小鼠分组和哮喘小鼠模型制作
　　30只SPF级小鼠按随机原则分组，分为对照组、哮喘组、干预组，每组小鼠各10只，参照文献制备哮喘小鼠气道重塑动物模型。哮喘小鼠模型的制作通过腹腔注射及雾化激发，并在每次雾化前给予1，25-(OH)2D3干预治疗。
　　2.肺组织标本的制备
　　致敏后的各组小鼠在末次雾化激发后的24小时内取肺组织标本，用于免疫组化和HE染色、RT-PCR操作。
　　3.HE染色
　　石蜡切片后，然后进行HE染色操作，在光学显微镜高倍镜视野(10×40)下应用计算机病理图像分析系统观察各组小鼠支气管气道壁结构形态变化，测定不同组别小鼠同级支气管壁厚度，并观察各组小鼠炎症细胞在支气管周围的浸润情况。
　　4.免疫组化染色
　　采用连续切片，每隔3张切片选取1张，每只小鼠随机选取3张切片，在组织切片上进行免疫组织化学染色操作。在光学显微镜高倍镜视野(10×40)下应用计算机病理图像分析系统观察测定阳性细胞中HMGB1/TLR4蛋白的表达。每个切片随机选择5个以上高倍镜视野，取平均IOD值作为该片的蛋白半定量结果。
　　5.逆转录-聚合酶链式反应检测HMGB1及TLR4mRNA表达
　　用-80℃保存的新鲜小鼠肺组织行RT-PCR操作，目的基因HMGB1/TLR4mRNA的表达量以的HMGB1/TLR4的DNA条带和GAPDH的DNA条带灰度值的比值表示。
　　统计学分析
　　采用SPSS17.0统计软件对数据处理。用均数±标准差（(x)±s）来表示计量资料，多组计量资料的比较采用单因素方差分析，LSD-t法用于组间数据的两两比较。Pearson相关分析方法用于分析两变量的相关性，P＜0.05为两组数据的差异存在统计学意义。
　　结果：
　　1.各组小鼠气道病理改变
　　在光学显微镜高倍镜视野(10×40)下应用计算机病理图像分析系统观察:对照组小鼠具有结构平滑、规则、整齐的支气管壁结构，上皮细胞无损坏、脱落，排列规整，气道壁厚度适中，较少的炎症细胞浸润;哮喘组小鼠支气管壁厚度增加，使支气管腔变窄，上皮细胞损坏、脱落，排列不规整，多数杯状细胞化生，大量炎性细胞浸润在支气管周围，可见大量粘液分泌;干预组气道壁厚度、管腔狭窄、杯状细胞化生数量、炎症细胞浸润数量较哮喘组减轻。各组间小鼠支气管壁厚度相互比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.各组小鼠免疫组化结果
　　在光学显微镜高倍镜视野(10×40)下应用计算机病理图像分析系统观察，HMGB1蛋白主要定位在炎性细胞及组织上皮细胞的细胞核、胞浆，TLR4主要定位在炎性细胞及上皮细胞的细胞膜、胞浆。HMGB1/TLR4表达呈阳性的细胞为深棕黄色细胞。对照组小鼠弱表达HMGB1及TLR4蛋白;哮喘组小鼠表达的HMGB1及TLR4蛋白较对照组升高，呈强阳性表达，与对照组相比，差异具备统计学意义(P＜0.05);干预组小鼠表达的HMGB1及TLR4蛋白显著低于哮喘组，但仍高于对照组，差异在统计学上有意义(P＜0.05)。
　　3.各组小鼠肺组织内HMGB1/TLR4mRNA检测结果
　　逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测结果显示，HMGB1/TLR4mRNA在哮喘组小鼠肺内的表达量比对照组明显增高，差异具备统计学意义(P＜0.05);干预组小鼠肺内HMGB1/TLR4mRNA表达量比哮喘组明显降低，较对照组增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.采用1，25-(OH)2D3对哮喘小鼠进行干预治疗可明显减轻哮喘小鼠气道炎症，并防止气道重塑的产生。
　　2.1，25-(OH)2D3可能是通过阻断HMGB1-TLR4信号传导通路来抑制下游炎症因子的释放，从而减轻哮喘小鼠气道炎症及气道重塑。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

1 引言

2 实验主要试剂、仪器和方法

2．1 实验试剂和仪器

2．2 实验操作具体流程

2．3 实验方法

2．4 统计学分析

3 实验结果

3．1 干预过程中各组小鼠一般情况

3．2 各组小鼠支气管形态改变

3．3 各组小鼠肺组织免疫组化结果

3．4 3组小鼠肺组织HMGB1及TLR4 mRNA检测结果

4 附图与附表

5 讨论

5．1 气道慢性炎症

5．2 气道高反应性

5．3 气道重塑

5．4 1，25-(OH)2D3对免疫系统的调节

结论

参考文献

综述 1，25-(OH)2D3、HMGB1、TLR4与哮喘的关系

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢