煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞恶变过程中表观遗传学改变

摘要

目的：
　　表观遗传学是不涉及DNA序列改变却可以调控基因表达水平和功能的可遗传的变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控;且表观遗传学的异常改变常发生于肿瘤形成的早期。为此，本课题以处理后煤焦沥青烟提取物(coartarpitchextracts，CTPE)为测试物，体外构建人支气管上皮细胞(humanbronchialepithelialcells，BEAS-2B)恶性转化模型，确认细胞恶变前提下，动态检测不同时期细胞表观遗传学变化包括基因组DNA甲基化水平;DNA甲基转移酶1(DNAmethyltransferasel，DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNAmethyltransferase3a，DNMT3a)、DNA甲基转移酶3b(DNAmethyltransferase3b，DNMT3b)、组蛋白去乙酰化酶1（histonedeacetylaseenzymeHDAC1）mRNA及蛋白表达水平;miR-21和miRlet-7a表达水平，探讨CTPE致细胞恶变过程中尤其是癌前病变中表观遗传学分子标志改变，为肺癌早期诊断、高发风险估计的提供更多高效标志。
　　方法：
　　据前期确定染毒剂量分为B(a)P阳性对照组、DMSO阴性对照组、煤焦沥青烟提取物染毒组（CTPE组）建立BEAS-2B细胞恶性转化模型。高效液相色谱法检测细胞基因组甲基化水平;Real-TimePCR检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1mRNA表达量及miR-21、miRlet-7a表达量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HADC1蛋白含量。
　　结果：
　　1.基因组DNA甲基化率:第10代各组细胞基因组DNA整体甲基化率差异均无统计学意义(P=0.069);20代时B(a)P组、CTPE组甲基化率均低于DMSO组，差异均有统计学意义(P＜0.001;P＜0.001)，B(a)P低于CTPE组差异有统计学意义（P=0.042）;30代时甲基化率进一步降低，3组差异有统计学意义(P=0.003)，B(a)P组与CTPE组相比，差异无统计学意义(P=0.322)。
　　2.DNMTs基因和蛋白表达情况:随传代次数增加，DMSO组DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA、蛋白表达量差异无统计学意义（均P＞0.05）;而DNMT1mRNA及其蛋白在B(a)P组、CTPE组表达量逐渐升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。DNMT3a在B(a)P组和CTPE组mRNA及其蛋白表达量均逐渐增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。DNMT3bmRNA和蛋白在B(a)P组和CTPE组的表达量逐渐增加，B(a)P组mRNA及其蛋白差异有统计学意义(P=0.005;P＜0.001)，CTPE组mRNA无统计学意义(P=0.131)，蛋白差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　3.HDAC1基因和蛋白表达情况:随传代次数增加，HDAC1mRNA及其蛋白在B(a)P组和CTPE组表达量均逐渐增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），DMSO组表达量差异无统计学意义(P=0.997;P=0.326)。
　　4.miRlet-7a和miR-21基因相对表达量:随传代次数增加，miRlet-7a在B(a)P组和CTPE组的表达量均逐渐增加，差异有统计学意义(P=0.013;P=0.002)，DMSO组表达量差异无统计学意义(P=0.996)。miR-21基因相对表达量随传代次数增加，B(a)P组和CTPE组的表达均逐渐增加，差异均有统计学意义(P=0.012;P=0.034)，DMSO组表达差异无统计学意义(P=0.999)。
　　结论：
　　1.CTPE诱导BEAS-2B细胞恶变过程与基因组DNA低甲基化，DNMTs、HDAC1、miR-21、miRlet-7a高表达有关，且通过它们之间的协同作用调节基因的表达，导致细胞发生恶变。
　　2.CTPE致BEAS-2B细胞恶变过程中表观遗传学分子可作为肺癌早期诊断及危险度评价的有效生物标志。

目录

声明

摘要

图表索引

英文缩略词表

1 引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验对象与受试物

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 主要试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞染毒及恶性转化细胞株的建立

2．2．3 细胞基因组甲基化水平检测

2．2．4 Realtime-PCR分析

2．2．5 ELISA检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1在细胞培养上清中的表达

2．2．6 统计分析

3 结果

3．1 各组细胞基因组DNA甲基化水平的检测

3．1．1 基因组提取DNA的完整性、纯度及浓度的检测

3．1．2 高效液相色谱法测定脱氧核苷标准品分析结果

3．2 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC mRNA水平的表达

3．2．1 细胞提取RNA的完整性、纯度及浓度的检测

3．3 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC蛋白水平的表达

3．4 miRlet-7a和miR-21水平的表达

3．5 CTPE组第10代、20代、30代细胞DNA甲基化率、DNMT1、-3a、-3b、HDAC1 mRNA、miRlet-7a、miR-21基因相对表达量相关性分析

4 讨论

4．1 CTPE刺激对基因组DNA甲基化率的影响

4．2 CTPE刺激对DNMTs表达的影响

4．3 CTPE刺激对HDAC1表达的影响

4．4 CTPE刺激对miRlet-7a和mi-21表达水平的影响

4．5 DNA甲基化率、DNMT1、-3a、-3b、HDAC1、miRlet-7a、miR-21基因相对表达量相关性分析

5 结论

参考文献

综述

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢