成纤维生长因子受体4在胃癌中作用的功能研究及其抑制剂和5-Fu作用机制

摘要

胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，其在亚洲的发病率高于其他几个洲。在我国胃癌的发病率和死亡率也都非常高。但是，我国早期胃癌的发现率约20％，且其常在癌症晚期或者因转移性胃癌而被发现。因此，我国多为进展期胃癌，并且预后比较差，常需要以手术治疗为主，放化疗等为辅的综合治疗手段。目前，胃癌的辅助化疗、姑息化疗的方案很多，其中以铂类和氟尿嘧啶为一线药物，如顺铂+氟尿嘧啶，氟尿嘧啶+奥沙利铂，DCF,ECF等，但其生存时间并不理想。近年来，靶向药物在胃癌的治疗中成为一大热点。由于胃癌的发生发展是一个具有多因素、多阶段和多种基因共同参与的过程，因此其发病机制并不清楚，目前除了赫赛汀外，多数药物在胃癌研究中并未取得突破。所以寻找新的靶基因，阐明胃癌的发生发展机制对治疗胃癌有重要的作用。
　　成纤维生长因子(FGFRs)是免疫球蛋白基因超家族成员，分布在多种细胞膜上。近年来，关于FGFR家族分子在不同肿瘤中的报道日益增多，其中以FGFR4多肽性位点Gly388Arg研究最多。部分研究者认为，FGFR家族在恶性肿瘤诊治方面有广阔的应用前景。但迄今为止，FGFR4在胃癌中的研究很少。FGFR4在常见的恶性肿瘤如胰腺癌、横纹肌肉瘤、乳腺癌以及肾细胞癌中均呈高表达。
　　迄今发现的20多种成纤维生长因子（FGF）中有10个能与FGFR4结合，其中仅有FGF19与FGFR4特异性结合。FGFR4激活后能够使FGF19促进肝细胞增殖，诱导肝癌形成。一些报道显示 PD173074（简称 PD）与 FGFR家族有很好的亲和力和选择性，并且PD能够抑制肝癌细胞增殖。部分研究证明，PD能够逆转FGF19特异性的刺激AFP产量增加，从而推测PD能够抑制FGFR4的活性。
　　由于目前 FGFR4在胃癌中的研究比较少，因此本课题着重探讨 FGFR4在胃癌发生发展中的作用，为胃癌的早期诊断以及预后，基因治疗提供强有力的理论依据。
　　本实验通过体内体外功能学实验检测 FGFR4在不同来源胃癌细胞系中的生物学特性的表达异同，探讨成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）在胃癌（GC）的功能，并探讨 FGFR4针对胃癌治疗的价值。通过慢病毒构建 FGFR4过表达细胞株，用于裸鼠胃癌模型的建立，进行体内体外相关实验，检测不同 FGFR4表达组的成瘤情况。利用5-Fu和 PD173074单药或联合，干预慢病毒处理的细胞株，进行体外相关实验，探讨两药联合后对胃癌生物学行为的影响和机制，更全面的研究FGFR4在胃癌发生发展中的作用，为PD173074应用于胃癌临床治疗提供依据，为胃癌的预后提供新的评价指标。
　　第一部分成纤维生长因子受体4在胃癌中作用的功能研究
　　第一章纤维生长因子受体4在胃癌细胞系中作用的功能研究
　　背景与目的：
　　胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，在我国，早期胃癌的发现率约20%，常在癌症晚期或者因转移性胃癌而被发现。我国多为进展期胃癌，并且预后比较差，常需要以手术治疗为主，放化疗等为辅的综合治疗。目前，胃癌的辅助化疗、姑息化疗的方案很多，其中以铂类和氟尿嘧啶为一线药物，如顺铂+氟尿嘧啶，氟尿嘧啶+奥沙利铂，DCF,ECF等，但其生存时间并不理想。近年来，靶向药物在胃癌的治疗中成为一大热点。但除了赫赛汀外，多数药物在胃癌研究中并未取得突破。所以寻找新的靶基因，阐明胃癌的发生发展机制对治疗胃癌有重要的作用。成纤维生长因子(FGFRs)是免疫球蛋白基因超家族成员，分布在多种细胞膜上。近年来，关于FGFR家族分子在不同肿瘤中的报道日益增多，其中以FGFR4多肽性位点Gly388Arg研究最多。部分研究者认为，FGFR家族在恶性肿瘤诊治方面有广阔的应用前景。但迄今为止，FGFR4在胃癌中的研究很少。本研究旨在通过慢病毒载体介导，构建成 FGFR4过表达细胞株，研究FGFR4对胃癌细胞系增殖能力，侵袭能力，凋亡的影响。检测不同处理组效应蛋白表达的变化，探讨FGFR4对胃癌细胞生物学行为影响的机制。
　　方法：
　　利用Real-time PCR检测FGFR4在胃癌细胞系HGC27，MKN45，MKN28，MGC803，BGC823，SGC7901,293T中的表达情况，筛选出FGFR4低表达细胞株。通过慢病毒构建FGFR4过表达细胞株，通过CCK8检测过表达细胞株和正常细胞株增殖情况的改变。流式细胞分选仪检测FGFR4对胃癌细胞系凋亡的影响，以及通过Transwell检测其侵袭能力的改变。Western Blot检测不同处理组效应蛋白表达的变化。
　　结果：
　　本研究构建成功 FGFR4过表达细胞株，分别设正常细胞组，阴性质粒组以及FGFR4过表达细胞组。其中FGFR4过表达细胞组较正常组及阴性质粒对照组的增值率和侵袭能力均增强，凋亡率降低。PCNA和Bcl-xl的表达增高，凋亡相关蛋白表达降低。
　　结论：
　　本研究从不同恶性程度的胃癌细胞株中筛选出两株FGFR4低表达细胞株，并通过慢病毒转染将其构建成FGFR4高表达胃癌细胞株，通过研究其过表达后增殖能力，侵袭能力，凋亡情况以及凋亡相关蛋白发现FGFR4过表达后的胃癌细胞株增殖能力增强，凋亡率减少，侵袭能力增强，提示FGFR4能够促进胃癌细胞生长，增加其恶性程度，促进胃癌细胞侵袭性。
　　第二章成纤维生长因子受体4在裸鼠成瘤中作用的研究
　　背景与目的：
　　FGFR4在常见的恶性肿瘤如胰腺癌、横纹肌肉瘤、乳腺癌以及肾细胞癌中均呈高表达。迄今发现的20多种成纤维生长因子（FGF）中有10个能与FGFR4结合，其中仅有FGF19与FGFR4特异性结合。FGFR4激活后能够使FGF19促进肝细胞增殖，诱导肝癌形成。由于目前FGFR4在胃癌中的研究比较少，因此本课题着重探讨FGFR4在胃癌发生发展中的作用，为胃癌的早期诊断以及预后，基因治疗提供强有力的理论依据。
　　方法：
　　将FGFR4过表达细胞株和相应未处理的胃癌细胞株皮下注射至裸鼠背部，构建裸鼠胃癌模型。接种6-8周后，观测不同处理组成瘤体积，大小指标的变化。通过TUNEL法检测不同组的组织中细胞凋亡情况。
　　结果：
　　皮下注射FGFR4过表达MBGC803和BGC823细胞株的裸鼠瘤体积明显大于阴性对照组和空白对照组，且此差异具有统计学意义（P<0.05）。此差异尤其在细胞注射后第10天，13天和16天最为明显。通过TUNEL法检测组织中细胞凋亡情况发现FGFR4高表达组的MGC803和BGC823中凋亡减少。
　　结论：
　　FGFR4的过表达能够促进胃癌细胞在体内的增长，减少细胞凋亡。故我们推测高表达的FGFR4可能会加速晚期胃癌的进展。
　　第二部分成纤维生长因子受体4抑制剂和5-Fu在胃癌中作用机制的研究
　　背景与目的
　　PD173074（简称PD）与FGFR家族有很好的亲和力和选择性，近年来一些学者认为PD能够抑制肝癌细胞增殖。尽管不能排除PD可能通过抑制FGFR1、FGFR2或FGFR3而达到抑制细胞增殖的目的，但是PD能够逆转FGF19特异性的刺激AFP产量增加，提示了PD主要是通过抑制FGFR4而抑制细胞增殖。此外，PD对FGFR4高表达的肝癌细胞株 HuH7d的抗增殖作用显著强于FGFR4低表达的肝癌细胞株及非癌细胞株，因此进一步说明FGFR4相对于其他FGFRs亚型而言，对PD的效能发挥起到更重要的作用。FGFR4在胃癌中的研究甚少，因此我们将着重探讨FGFR4在胃癌发生发展中的作用。
　　方法：
　　PD173074和5-Fu单药或两药联合处理FGFR4过表达细胞株，分别以各自未行处理的细胞株作为对照，进行一系列体外功能试验，评价PD173074和5-Fu对FGFR4不同表达水平的胃癌细胞株的生物学行为的影响。同时在分子水平上检测不同处理因素作用后，细胞增殖，凋亡及细胞凋亡相关蛋白表达的变化。
　　结果：
　　单用5-Fu和PD以及两药联合后对胃癌细胞株MGC803和BGC823的细胞增殖起到抑制作用，且增加细胞的凋亡率。将这两株细胞通过转染技术构建FGFR4过表达细胞株后，细胞对5-Fu和PD以及两药联合的敏感度降低，细胞增殖所受的抑制作用减轻，凋亡率较未过表达的细胞株降低。
　　结论：
　　单用5-Fu和PD以及两药联合后对胃癌细胞株MGC803和BGC823的细胞增殖起到抑制作用，且增加细胞的凋亡率。过表达FGFR4能够减轻5-Fu和PD对胃癌细胞株的增值抑制作用，若想和正常胃癌细胞得到相同的增殖抑制情况必须加大5-Fu和PD的给药剂量，以获得满意的疗效。
　　全文结论：
　　通过转染慢病毒构建FGFR4过表达胃癌细胞株，进行体内体外功能学实验。FGFR4过表达后通过增加肿瘤细胞的侵袭能力和增殖能力来减少肿瘤细胞的凋亡程度，提高肿瘤的恶性程度。将5-Fu和PD单用及两药联合处理正常胃癌细胞株后，发现单用和联合治疗均能降低细胞增殖，增加细胞凋亡率。此细胞增殖的抑制作用和凋亡情况的增加在FGFR4过表达的胃癌细胞株中得到明显改善。但5-Fu和PD的联合治疗的价值和前景还需要我们进一步验证，为临床提供治疗依据。

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缩写词对照表

引言

第一部分 成纤维生长因子受体4在胃癌中作用的功能研究

前言

第一章 纤维生长因子受体4在胃癌细胞系中作用的功能研究

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二章 纤维生长因子受体4在裸鼠成瘤中作用的研究

1 实验材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二部分 成纤维生长因子受体4抑制剂和5-Fu在胃癌中作用机制的研究

前言

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

全文结论

参考文献

综述:成纤维生长因子受体（FGFRs）的研究现状

个人简历

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢