脑区硫铵素缺乏引发的轴突病变与阿尔茨海默病的病理机制的联系

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)作为目前世界上最为常见的神经退行性神经疾病，具有发病率和致死率高的特点，因而逐渐成为重要的全球公共卫生问题。AD的发病机制研究日益受到世界各国政府和广大学者的高度重视，但目前为止其发病原因和机制仍是一个未解的谜团。近年来越来越多的研究发现表明，轴突病变与阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发生密切相关，轴突病变的产生不仅早于AD的两个特征性病理改变：即老年斑（senile plaque，SP）和神经纤维缠结（neurofibrillary tangle，NTF），而且轴突漏的发现更被认为是AD的重要发病机制之一。但是轴突病变是否与老年斑的产生沉积有所关联却不得而知。此外，如何解释老年斑在脑区的沉积的位置有可能与AD的临床表现不完全一致，这一问题也一直未完全阐明。因此，为了探讨轴突病变与阿尔茨海默病老年斑产生的关系，我们选择4个月野生型C57BL/6小鼠和同龄的经过鉴定的 APP/PS1阿尔茨海默病双转基因小鼠，采用在小鼠海马齿状回、内嗅皮层及前皮质脑区注射硫胺素拮抗剂吡啶硫胺(pyrithiamine)的方式诱导神经细胞硫胺素缺乏(Thiamine Deficiency，TD)建立特定脑区神经回路轴突病变动物模型。在TD处理前及TD处理后10天进行动物认知行为检测，TD处理后30天应用免疫荧光、神经示踪技术、Western-blot及RT-PCR观察注射脑区及其投射回路脑区内轴突的形态学、Aβ和过度磷酸化 tau蛋白表达的改变。结果发现：TD处理后APP/PS1小鼠和C57BL/6小鼠的主，被动规避行为与对照组相比有显著下降（P<0.05）,TD处理后30天，两种小鼠脑区内过度磷酸化tau蛋白，Aβ呈现高表达，值得一提的是，我们不但发现吡啶硫胺注射的脑区内呈现轴突病变改变包括轴突和轴突膨体肿胀以及“轴突漏”，而且注射脑区神经元的投射脑区也发现有显著的轴突病变，在 APP/PS1小鼠出现轴突病变的投射脑区还伴随有斑块形成。综合上述结果提示：TD处理引起的轴突病变与AD的传统病理发生和发展的过程存在关联，而病变神经元投射脑区的轴突病变特别是轴突漏的改变可能是导老年斑沉积脑区与其功能改变和临床表现不一致的主要原因。
　　第一部分APP/PS1小鼠的饲养与鉴定方法比较
　　方法：
　　1.分别挑选健康的成年APP/PS1小鼠20只和C57BL/6小鼠(以下简称WT小鼠)10只，按照♂APP/PS15只+♀C57BL/65只为组1和♀APP/PS15只+♂C57BL/65只为组2，♂APP/PS15只+♀APP/PS15只为组3的方式分为3组，分别观察3个月并记录各组别母鼠的繁殖次数，小鼠产量及小鼠成活数量。
　　2.分别用血液基因组 DNA提取方法与组织基因组 DNA提取方法提取待鉴定的APP/PS1子代小鼠的DNA。
　　3.将两种方法提取的DNA进行PCR扩增及产物分析，将两种方法所得的阳性产物进行比较。
　　结果：
　　1.组1与组2和组3的子代产量和子代存活数量相比较 P<0.01，即采用♂APP/PS1+♀C57BL/6的交配方式可以获得更多更健康的子代小鼠。
　　2.相同条件下用组织基因组 DNA提取方法进行鉴定其阳性率明显高于用血液基因组DNA提取方法。
　　第二部分脑区TD处理模型的建立与动物行为学检测
　　方法：
　　1.将APP/PS1小鼠及WT小鼠分组并称重麻醉后,按照小鼠脑图谱在右海马齿状回、右内嗅皮层、右前皮质立体定位注射 pyrithiamine（5μg／g体重）。注射后缝合皮肤，抗生素抗感染治疗后送入动物房观察。
　　2．分别在小鼠TD处理前和TD处理后10天使用主、被动规避仪对实验小鼠进行主、被动规避实验检测
　　结果：
　　1.主动规避实验结果显示：APP/PS1和WT小鼠条件反应次数TD处理后较TD处理前降低非常明显（P<0.01），而非条件反应次数及无反应次数TD处理后分别较TD处理前明显增多（P<0.05，P<0.01）。
　　2.被动规避实验结果显示：APP/PS1小鼠和WT小鼠TD处理后STL时间明显缩短（P<0.01）。
　　第三部分脑区TD处理导致的轴突病变与AD病理机制的联系
　　方法：
　　1.选择右海马齿状回、右内嗅皮层、右前皮质分别注射神经示踪剂（BDA）。
　　2.分别选择在TD处理后10天和30天对实验小鼠灌注取脑，进行冰冻切片组织准备。
　　3.用ABC染色法进行冰冻切片的染色使神经示踪剂BDA显色。
　　4.提取蛋白进行Western blot，比较TD前后各组小鼠脑内Aβ含量的变化
　　5.提取各组小鼠脑组织RNA，运用Real-TimePCR，检测TD前后各组小鼠脑内β-APP基因表达的变化。
　　6.免疫荧光双标检测TD前后各组小鼠脑内Aβ及AT8（过度磷酸化的tau蛋白）的表达
　　结果：
　　1.APP/PS1小鼠和WT小鼠TD处理后10天注射脑区可以出现轻微的轴突病变，表现为轴突轻度肿胀及部分膨体肿胀出现，APP/PS1小鼠和WT小鼠TD处理后30天注射脑区及投射脑区均出现明显的轴突病变，表现为轴突严重肿胀及膨体肿大，甚至有轴突漏出现。APP/PS1小鼠部分脑区可以看到老年斑出现。
　　2. Western blot显示 APP/PS1小鼠和 WT小鼠 TD处理后 Aβ呈现高表达（P<0.01）。
　　3. Real-TimePCR检测显示APP/PS1小鼠和WT小鼠TD处理后30天β-APP基因表达明显上调（P<0.01）。
　　4.免疫荧光显示APP/PS1小鼠和WT小鼠TD处理后30天各组Aβ及AT8呈现高表达。

目录

封面

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中文摘要

英文摘要

英文缩略词表（Abbreviation）

目录

前言

第一部分APP/PS1小鼠的饲养与鉴定方法比较

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 脑区TD处理模型的建立与动物行为检测

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 脑区TD处理导致的轴突病变与AD病理机制的联系

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述:轴突病变与阿尔茨海默病发病机制联系的研究进展

个人简历

在读期间发表的学术论文及获奖情况

★主要参与的研究课题

致谢