小鼠小脑片层化过程中神经元迁移及reelin蛋白可能作用的实验性研究

摘要

小脑由胚胎早期的菱脑分化而来，在中枢神经系统中，参与调节机体的平衡和肌肉张力，协调随意运动，并且同人体的学习、记忆神经活动有着密切的关系。小脑为具有典型的皮质板层结构的脑区，小脑的板层形成始于生后并于生后第三周形成小脑典型的三层结构，分别为最内层为颗粒细胞层，中间层是浦肯野细胞层和最外层是分子层。当小鼠小脑发育成熟后，典型的小脑三层结构中共有五种不同类型的神经细胞，五种神经元中最具有特征性的是体积较小的颗粒细胞和体积巨大的浦肯野细胞（Purkinje cell），其中，浦肯野细胞是从小脑皮质发出的唯一能够传出兴奋的神经元，如果受到损伤，则可以导致共济失调，而颗粒细胞是小脑数量最多的神经元。Reelin是由位于新皮质和古皮质分子层的Cajal-Retzius(C-R)细胞分泌的糖蛋白，作为神经细胞迁移终止信号，它在神经系统发育过程中起着十分重要的调控作用，虽然，reeler小鼠海马形态、齿状回结构的研究颇多，但对小脑皮质组织化学特征的观察，国内尚少见有关报道。为了更好地了解reeler小鼠神经系统的畸形，对其小脑组织化学特征研究显得尤为必要。所以，本研究采用免疫荧光、Nissl和HE染色方法探讨小鼠小脑片层化过程中细胞迁移及Reelin蛋白的可能作用，将会使我们更加深层次了解神经系统的发育过程及其规律，同时也有可能为临床上神经系统疾病的诊断和治疗提供了重要的借鉴价值。
　　目的：
　　观察小鼠小脑皮质片层化的组织发生过程细胞迁移，探讨片层化和细胞迁移之间的关系，同时分析reelin蛋白对小脑片层化和细胞迁移的影响。
　　方法：
　　不同年龄的小鼠172只，应用免疫荧光、Nissl和HE染色法对不同年龄的小鼠小脑形态结构及片层化、细胞迁移观察，并对内外颗粒细胞层厚度、浦肯野细胞密度进行统计。
　　结果：
　　①小脑片层化的形成：E15-E16早期的菱脑主要由神经上皮构成，发育至P0时小脑皮质基本形成了三层结构，分别是外颗粒层（也即分子层），浦肯野细胞层及颗粒层。随着小脑的不断发育，P5时浦肯野细胞层形成2-3层细胞，分子层仍有大量细胞。发育至P20左右，小鼠小脑的分子层内有大量浦肯野细胞树突，且此层已经基本不含神经元，形成了小脑的典型三层结构：分子层、浦肯野细胞层及颗粒层，此时，小脑的片层化过程基本完成。②细胞迁移过程：浦肯野细胞大约在E18时开始迁移，随着年龄增长，发育至P7时，已基本完成它的迁移，此时胞体较大呈梨形,有少量突起,排列稀疏，形成均一的1-2层细胞结构。同时，小鼠小年龄时，NeuN阳性细胞主要分布在内颗粒层和外颗粒层，P7后阳性细胞只定位在内颗粒层，其原因是外颗粒层阳性细胞凋亡和（或）外颗粒层阳性细胞迁移到内颗粒层，此时迁移基本停止。统计学分析表明， P3以后外颗粒层逐渐变厚，P7达最厚约0.08mm，以后逐渐变薄，至P20左右消失，而内颗粒层呈现S型增厚，浦肯野细胞密度呈S型曲线逐渐减少。③WT和reeler小鼠比较：约P14时，WT小鼠小脑形成分子层、浦肯野细胞层及颗粒层，此三层结构排列紧密且分布规律。但是在reeler小鼠，小脑分叶不良，浦肯野细胞未迁移至目的地，细胞排列紊乱，颗粒细胞层（ GL）可见散在的Calbindin阳性细胞，胞体突起较少，且不规则。（内）颗粒层（GL）细胞分布松散、不均一，片层化紊乱，周围充满颗粒细胞，中央仅有散在的少数颗粒细胞。
　　结论：
　　①在小鼠小脑经历了细胞增殖、分化和迁移过程后，完成了片层化形成过程。其中，细胞迁移对小脑片层化的形成起着非常重要的作用。②Reelin蛋白作为神经细胞迁移终止的信号蛋白，还具有细胞增殖的调控作用，对小脑神经元迁移、发育过程中皮质板的片层化，特别是对调节颗粒细胞和浦肯野细胞有明显调控作用。

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缩略词

引言

1 材料和方法

1.1 实验动物

1.2 实验材料

1.3 实验试剂及配方

1.4 主要仪器

1.5 制作小脑切片

1.6 苏木精-伊红（HE）染色

1.7 尼氏（Nissl）染色

1.8 免疫组织化学荧光染色

1.9 统计学处理

2 实验结果

2.1 小脑皮质片层化形成过程

2.2 小脑内浦肯野细胞迁移的规律

2.3 颗粒细胞的迁移

2.4 野生型和reeler小鼠(P14)小脑形态比较

3 讨论

3.1 小脑皮质片层化的形成

3.2 小脑皮质中神经元的分化及对片层化的影响

3.3 小脑皮质中钙结合蛋白与片层化的关系

3.4 Reelin蛋白对小脑发育的影响

结论

参考文献

综述:Reelin在不同组织器官生理和病理中的研究现状

个人简历、在学期间所发表的学术论文与研究成果

致谢