HOI-02通过ROS诱导食管癌细胞凋亡和G2-M期阻滞的机制研究

摘要

在全世界范围内，食管癌一直是最具致命性的恶性肿瘤之一，其发病率在逐年增长，每年约有22万人死于食管癌。然而，由于食管癌的易向局部和远处转移的高侵袭性以及对化疗的不敏感性，食管癌的治疗仍是一个棘手的问题。因此，致力于有效的化合物或药物的研究就显得非常必要和迫切,同时探讨其作用机制也为开发新的药物提供重要的治疗策略。
　　ROS(Reactive oxygen species，活性氧族)的产生是非手术方法（例如：化疗和放疗）治疗肿瘤的共同特征，因为ROS能够诱导肿瘤细胞的死亡。目前，诱导ROS的产生已成为治疗肿瘤的一个新手段。ROS,特别是H2O2(过氧化氢),在细胞信号转导过程中可以作为第二信使发挥作用。H2O2通过改变靶蛋白（包括蛋白质酪氨酸磷酸酶，蛋白质酪氨酸激酶，转录因子和受体酪氨酸激酶）的氧化压力来调节蛋白的活性。这类药物治疗肿瘤的优势在于他杀伤细胞的高度选择性。一般情况下，肿瘤细胞具有较高的氧化压力，因此也具有相对较高的 ROS水平，在这种环境下，如果肿瘤细胞内的ROS水平被诱导继续升高，就会超过细胞耐受的阈值而导致细胞死亡，有趣的是，正常细胞则受影响较小，因为正常细胞的ROS水平相对较低，而且具有强大的抗氧化系统。因此，研发有效的产生ROS类药物将为肿瘤治疗提供新的方法，探讨其作用机制也为此类药物的研发提供理论依据。
　　在本研究中，我们自主研发合成了化合HOI-02，并发现HOI-02能够诱导食管癌细胞ROS的产生，并且抑制食管癌细胞的增殖和锚定非依赖性生长，进一步研究发现，HOI-02诱导产生ROS继而导致细胞凋亡和G2-M期阻滞并最终抑制肿瘤细胞生长。数据显示，HOI-02处理食管癌细胞24h可以导致近60％的细胞凋亡以及 G2-M期阻滞，与细胞凋亡和细胞周期阻滞相关的通路 JNK/AP-1, Bcl2/caspase3和ATM/p53-p21被激活。同时，在体内实验人源性肿瘤组织异体移植模型中，HOI-02也能够明显的抑制肿瘤组织质量和体积的增长。体内外实验表明，HOI-02具有较好的抑制食管癌细胞和组织生长的能力。同时，HOI-02作为NO2基团的化合物，和被替换为NH2基团的化合物HOI-11相比较之后，我们发现HOI-02能够产生ROS并导致细胞凋亡和G2-M期阻滞并最终抑制肿瘤细胞的生长，而HOI-11则不能对食管癌细胞产生效应。由此我们判断NO2基团是产生O2-的来源，这将为研发能够产生ROS的药物提供线索和依据。
　　第一章 HOI-02能够抑制食管癌细胞的活性和锚定非依赖性生长
　　方法
　　1.设计并合成化合物HOI-02和HOI-11；
　　2.利用MS/MS方法检测化合物HOI-02和HOI-11的纯度；
　　3.MTS法检测HOI-02和HOI-11对食管癌细胞活性的影响；
　　4.利用软琼脂克隆形成实验检测HOI-02和HOI-11对食管癌细胞锚定非依赖性生长的影响。
　　结果
　　1.设计并合成了高纯度的化合物HOI-02和HOI-11
　　2. HOI-02能够剂量依赖性的抑制食管癌细胞的活性，而HOI-11对食管癌细胞影响不大
　　MTS结果显示，HOI-02处理食管癌细胞KYSE30和 KYSE510后能够抑制细胞活力，且呈浓度和时间梯度依赖。10μM和20μM HOI-02处理KYSE510细胞48h，吸光度光谱490nm吸光值由0.5534分别降为0.25(P<0.01)和0.093(P<0.01)，呈浓度梯度依赖。而HOI-11处理的食管癌细胞系KYSE30和 KYSE510的细胞活性状况则受影响较小。10μM和20μM HOI-11处理KYSE510细胞48h，吸光度光谱490nm吸光值由0.4114分别降为0.3972(P>0.05)和0.394(P>0.05)。
　　3. HOI-02能够抑制食管癌细胞的锚定非依赖性生长，而HOI-11对食管癌细胞影响不大
　　软琼脂克隆形成实验结果显示，HOI-02能够明显的抑制食管癌细胞KYSE30， KYSE450和 KYSE510的锚定非依赖性生长。1μM HOI-02对KYSE510即有明显的抑制作用(P<0.05)，5μM HOI-02能够抑制70%的 KYSE510细胞的生长(P<0.01)，呈浓度梯度依赖。而食管癌细胞KYSE30和KYSE510的锚定非依赖性生长情况则受HOI-11影响较小。10μM HOI-11对食管癌细胞克隆形成没有明显影响，仅仅20μM HOI-11时对细胞克隆形成有部分抑制作用。
　　第二章 HOI-02能够诱导食管癌细胞凋亡和G2-M期阻滞
　　方法
　　1.流式细胞仪检测HOI-02对食管癌细胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滞的影响；
　　2.流式细胞仪检测HOI-11对食管癌细胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滞的影响；
　　3. TUNEL法分析HOI-02对食管癌细胞KYSE510凋亡的影响。
　　结果
　　1. HOI-02能够诱导食管癌细胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滞
　　流式细胞仪结果显示，相比对照组，20μM HOI-02处理食管癌细胞KYSE51024h能够诱导48.24%的细胞凋亡（早期和晚期凋亡分别是20.89%和27.15%， P<0.01）和40.43%的G2-M期阻滞(P<0.01)，并呈浓度梯度依赖。
　　2. HOI-11处理对食管癌细胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滞的影响较小
　　流式细胞仪结果显示，HOI-11处理食管癌细胞对凋亡和细胞周期阻滞影响不大。相比对照组，20μM HOI-11处理细胞KYSE51024h仅能够诱导4.63%的细胞凋亡和2.11%的G2-M期阻滞。
　　3. TUNEL法表明HOI-02能够明显诱导食管癌细胞KYSE510凋亡
　　TUNEL分析结果显示，TUNEL绿色荧光强度与HOI-02浓度呈剂量相关性。相比对照组，5μM HOI-02能够诱导部分细胞凋亡，TUNEL绿色荧光强度增加，20μM HOI-02能够明显的诱导细胞凋亡，TUNEL绿色荧光强度明显增强。
　　第三章 HOI-02能够诱导ROS的产生
　　方法
　　1.通过DCFH-DA染色，用流式细胞仪检测HOI-02和HOI-11处理食管癌细胞KYSE510时ROS的生成情况；
　　2.在HOI-02/NADPH/FMN体系中，利用自旋捕获剂DMPO监测ROS信号的生成；
　　3. MTS法检测HOI-02与不同抗氧化剂NAC，GSH, Catalase和SOD共处理时对细胞活性的影响；
　　4.流式细胞仪检测HOI-02与抗氧化剂NAC和GSH共处理时对细胞凋亡和G2-M期阻滞的影响。
　　结果
　　1. HOI-02能够明显的诱导ROS产生，而HOI-11不能够明显诱导ROS的生成
　　流式细胞仪结果显示，20μM HOI-02处理食管癌细胞KYSE5101h,3h,6h,12h和24h,其中处理1h既有ROS的生成（44.72%），6h时达到峰值（88.05%），24h时降低为32.18%。相比较HOI-02，HOI-11对细胞影响较小。
　　2.在HOI-02/NADPH/FMN体系中，能够检测到较强的自由基信号，而在HOI-11/NADPH/FMN体系中则不能
　　EPR结果显示，在电子捕获剂DMPO的作用下，HOI-02/NADPH/FMN体系能够产生明显的自由基信号，去除HOI-02后不能够产生自由基信号。同时如果在此体系中增加上GSH或者Catalase,就发现自由基信号消失或减弱。而如果在体系中增加 SOD，自由基信号基本不受影响，同时 HOI-11/NADPH/FMN体系也不能够产生信号，说明相比较 HOI-02，HOI-11在此反应体系中不能够产生ROS。
　　3.抗氧化剂NAC和GSH能够抵消HOI-02对细胞的增长抑制作用
　　MTS结果显示，用20μM HOI-02与抗氧化剂2.5mM NAC或者2.5mM GSH共处理食管癌细胞KYSE510时，能够抵消HOI-02对细胞增殖的抑制，细胞的生长状况与对照组相似。Catalase能够部分抵消HOI-02对细胞增殖的抑制，而SOD与HOI-02共处理细胞时，细胞的增殖状况基本不受影响。
　　4.抗氧化剂NAC和GSH能够抵消HOI-02对细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响
　　流式细胞仪结果显示，20μM HOI-02处理食管癌细胞KYSE51024h能够引起明显的细胞凋亡和G2-M期阻滞，而20μM HOI-02与2.5mM NAC或者2.5mM GSH共处理细胞时，细胞不发生凋亡和细胞周期阻滞。
　　第四章 HOI-02通过调节AP-1活性和caspase蛋白的表达诱导细胞凋亡
　　方法
　　1. Western blotting检测HOI-02不同时间以及不同浓度处理食管癌细胞KYSE510时对凋亡相关蛋白表达水平的影响；
　　2. Western blotting检测500μM H2O2处理细胞后对凋亡相关蛋白表达水平的影响；
　　3.荧光素酶报告基因的法检测AP-1活性的变化。
　　结果
　　1. HOI-02处理细胞使凋亡相关蛋白被激活
　　Western blotting结果显示，20μM HOI-02处理食管癌KYSE510细胞后，p-c-jun, p-c-fos, p-JNK, p-P38, c-PARP,c-caspase3和Bax表达增加，同时下调Bcl2的表达。不同浓度的HOI-02处理细胞后p-c-jun和p-c-fos的表达呈浓度梯度依赖，且HOI-02与NAC或者GSH共处理细胞后p-c-jun和p-c-fos的表达消失。
　　2.500μM H2O2处理细胞后相关凋亡相关蛋白被激活
　　Western blotting结果显示，500μM H2O2处理食管癌KYSE510细胞后，p-c-jun, p-c-fos, p-JNK和p-P38表达增加，我们发现与H2O2相比，HOI-02处理细胞能够激活同样的凋亡相关蛋白通路。
　　3.随着HOI-02处理细胞浓度增加，转录因子AP-1的活性随之增加，同时抗氧化剂能够抵消AP-1活性的增加
　　荧光素酶报告基因检测显示，相比对照组,20μM HOI-02处理食管癌KYSE510细胞后转录因子AP-1升高2倍多，并呈浓度梯度依赖。同时，20μM HOI-02与2.5mM NAC或者2.5mM GSH共处理时，细胞内AP-1活性恢复正常。
　　第五章 HOI-02通过调节P21相关的通路诱导细胞G2-M期阻滞
　　方法
　　1. Western blotting检测20μM HOI-02不同时间以及不同浓度 HOI-02处理食管癌细胞KYSE510对G2-M期阻滞相关蛋白表达水平的影响；
　　2.分析HOI-02处理食管癌KYSE510后各种相关蛋白的表达情况，建立HOI-02作用机制模型。
　　结果
　　1. HOI-02处理细胞使细胞周期G2-M期相关蛋白被激活
　　Western blotting结果显示，20μM HOI-02处理食管癌KYSE510细胞后， p-CDC2, p-ATR, p-ATM, p-H2AX, p-P53和P21升高，p-CyclinB1（S147）降低，不同浓度的HOI-02处理细胞后p-CDC2, p-H2AX和P21的表达呈浓度梯度依赖，且HOI-02与NAC或者GSH共处理细胞后p-CDC2, p-H2AX和P21的表达消失。2. HOI-02作用机制分析
　　HOI-02处理食管癌KYSE510细胞后，分析相关蛋白的变化，发现细胞凋亡要是通过JNK/c-jun,c-fos/AP-1和BCL2/caspase3途径发生，而ATM/P53-P21通路蛋白的变化则引起了G2-M期阻滞。
　　第六章在人源性肿瘤组织异种移植模型中，HOI-02能够抑制肿瘤生长
　　方法
　　1.通过人源性肿瘤组织异体移植模型（PDX）验证HOI-02对食管癌组织的生长抑制作用；
　　2.免疫组化和免疫荧光法检测PDX模型中肿瘤组织的相关蛋白表达情况。
　　结果
　　1.在PDX模型中，HOI-02能够明显抑制食管癌组织质量和体积的增长
　　通过观察PDX模型中肿瘤组织的变化，我们发现HOI-02治疗食管癌组织周后，与对照组相比，HOI-02处理肿瘤组织6周后，低剂量组（10mg/kg）即能够明显降低肿瘤质量和肿瘤体积（p<0.01），HOI-02高剂量组（50mg/kg）对肿瘤生长抑制更为显著。
　　2.相关蛋白的免疫组化和免疫荧光分析
　　免疫组化结果显示,与对照组相比，HOI-02治疗后的肿瘤组织中Ki-67， p-c-jun，P21和c-caspase3的表达均增加，且呈剂量依赖性。同时，免疫荧光结果表明肿瘤组织中DCFH-DA的荧光强度随着HOI-02浓度的增加随之增强。
　　结论
　　1. HOI-02作为一新型的自主合成的化合物能够诱导ROS的产生，并由此通过JNK/c-jun,c-fos/AP-1和BCL2/caspase3通路引发细胞凋亡，通过ATM/P53-P21通路引发G2-M期阻滞，同时HOI-02也能够明显抑制食管癌细胞活性和锚定非依赖性生长。在体内实验人源性组织异体移植模型中，我们也发现HOI-02能够明显的抑制食管癌组织质量和体积的增长，这为药物的临床筛选奠定了实验基础，同时也对诱导ROS的药物作用机制有了更深入的认识。
　　2. HOI-02（含有一硝基基团-NO2）能够诱导产生ROS和肿瘤组织的生长抑制作用，而HOI-11（含有一氨基基团-NH2）则对食管癌细胞和组织生长影响不大，由此推断硝基基团-NO2是诱导产生ROS的主要原因，这为含有硝基基团- NO2类化合物的研发提供线索和依据，也为设计和合成更多的诱导ROS类药物提供理论基础。

目录

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中文摘要

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英文缩略词

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引言

参考文献(Reference)

第一章 HOI-02能够抑制食管癌细胞的活性和锚定非依赖性生长

1、材料与方法

2结果

第二章 HOI-02能够诱导食管癌细胞凋亡和G2-M期阻滞

1、材料与方法

第三章 HOI-02能够诱导ROS的产生

1、材料与方法

2 结果

第四章 HOI-02 通过调节AP-1活性和caspase蛋白的表达诱导细胞凋亡

1、材料与方法

2 结果

第五章 HOI-02 通过调节P21相关的通路诱导细胞G2-M期阻滞

1材料与方法

2 结果

第六章 在人源性肿瘤组织异种移植模型中，HOI-02 能够抑制肿瘤生长

1 材料与方法

2 结果

讨论

参考文献

全文结论

综述:ROS的特性及其抗肿瘤机制的研究进展

博士研究生期间发表论文、承担课题情况

致谢