白色念珠菌ERG11基因突变与其耐三唑类抗真菌药物的关系

摘要

背景：
　　近些年来，在真菌感染患者的临床治疗中免疫抑制剂、广谱抗生素以及糖皮质激素等的使用愈来愈多见，此外，诸如气管插管、呼吸机等侵入性治疗操作的使用频率愈来愈高，这些都可能导致患者中肺部真菌感染几率的增大。最多见的造成深部感染的真菌主要为念珠菌、青霉菌、曲霉菌、隐球菌、孢子丝菌、和毛霉菌等几种。深部真菌感染的愈后差，病死率高，药物应用相对局限。因此，对深部真菌感染的致病菌的鉴定对临床诊断、治疗、愈后等有着很重要的影响，但深部真菌感染的菌种鉴定是临床微生物实验室的一项难题。在传统的真菌的分类鉴定中，常采用的方法均是基于真菌菌种的形态学、生理生化等特点，并参考菌株的生理生化指标进行综合鉴定和分析。采用这种分析鉴定方法的弊端在于真菌菌株的检出及菌株的培养需过程需要保证特殊的培养环境和培养步骤；另外，由于实际培养中大部分的真菌菌株的生长相对缓慢，这给真菌菌种的鉴定工作造成了相当的困难。最终也就降低了针对深部真菌感染的致病菌进行鉴定获得的鉴定结果对于临床治疗的意义。近年来，得益于分子生物学的快速发展和进步，利用分子生物学的方法能够快速、准确地对真菌菌种进行鉴定，且该方法的应用范围正变得愈来愈广泛，现已逐渐发展为真菌菌种鉴定的重要辅助手段之一。
　　念珠菌（Candida）在自然界中的分布即为广发，通常可以对人体的皮下组织、内脏和黏膜等造成侵袭，并且是能够引起目标对象全身性感染的条件致病真菌。在患者的临床诊治过程中，发现的致病真菌基本包括了白色念珠菌（Canida albicans）、光滑念珠菌（Canida glabrata）、热带念珠菌（Canida tropicalis）、近平滑念珠菌（Canida parapsilosis）以及克柔念珠菌（Canida krusel）等5大类。这里面在真菌的临床诊治上的致病菌以白色念珠菌出现概率最高。
　　白色念珠菌的Secreted Aspartyl Proteinases（SAP）多基因家族至少有九名成员（SAP1到 SAP9），通过编码分泌产出型天冬氨酸蛋白酶（Saps），而该蛋白酶能够参与到白色念珠菌对组织的侵袭性；白色念珠菌的组织侵袭性被公认为是白色念珠菌作为致病菌感染人体的重要致病因素。实验证实，当SAP6基因被敲除时，白色念珠菌的生存能力明显下降，对宿主细胞的侵袭力明显降低，对组织的损伤显著减少；因此，白色念珠菌所独有的功能性基因 SAP基因可用于白色念珠菌菌种的鉴定工作。
　　唑类抗真菌药物因其疗效好、抗菌谱广、生物利用吸收好、安全性比较高等优点，广泛应用于真菌感染的预防和治疗。但是，鉴于唑类抗真菌药物已长期、广泛应用于真菌制冷中，使得耐药菌株日渐多现，这使得肺部真菌病的防治难度愈来愈高。
　　白色念珠菌获得对唑类抗真菌药物的耐药性的具体机制不一而足，其中较为多见的一种机制如下，即编码唑类抗真菌药物靶酶的ERG11基因发生突变或过度表达，并最终引起白色念珠菌菌株的耐药性的产生，最为多见。唑类抗真菌药物的靶酶为由 ERG11基因通过编码产生的14α-去甲基化酶（CYP51）。若ERG11基因发生突变则会给Ergllp的氨基酸序列带来改变，从而使的14α-去甲基化酶的空间结构有了变化，致使酶分子与药物分子之间不能结合或结合力变弱，致使真菌获得耐药性。有研究发现，白色念珠菌菌株获得耐药性是通过唑类药物的靶酶的过量表达实现的，实验通过将耐药菌株和敏感菌株比较，发现大部分靶酶的mRNA含量升高的菌株，它们的 MIC值也有较明显的增高。
　　比较基因组学（comparative genomics）技术是将基因测序技术和基因组图谱二者相结合，通过将实际检测到的基因序列同目前已知的基因和基因组结构进行比较，从而对解基因的功能、基因的表达机制，乃至物种的进化过程等作出科学推断的技术学科。本研究通过对耐药白色念珠菌ERG11基因测序，与已知的标准白色念珠菌ERG11基因的进行比较，通过对比发现两者的基因序列中存在基因多态性差异，力图发掘出可能的与耐药性相关的基因；比较基因组学的方法对于念珠菌耐药机制研究的发展和进步有着极其重要的应用。
　　此次研究以白色念珠菌的ERG11基因为对象展开，通过比较基因组学的技术方法，对ERG11基因突变同念珠菌耐药性产生之间的相关性进行探讨。
　　材料与方法：
　　菌株的收集时间范围：2013年3月至2014年3月；菌株采集来源：郑州大学第一附属医院呼吸内二科住院部收治的肺部真菌感染患者中所采集到的符合标准的临床菌株共57株。菌株的培养：将临床上收集到的真菌菌株标本依时间先后顺序在沙保弱培养基上接种，温度条件维持在35℃，培养时间为24~48h；持续观察，当念珠菌生长显现出酵母样菌落时，从中挑取单个菌落，并在科玛嘉显色培养基上接种，培养温度35℃看，培养时间为24h；菌落鉴定的判据为培养菌产生颜色，若认为有必要则可使用由法国生物梅里埃公司生产的VITEK-32型全自动细菌分析系统中的YBC卡对念珠菌菌种进行进一步鉴定。（若鉴定发现为某菌株分离自同一患者相同部位，则将其排除）。
　　应用ATBFugus3试条对32株白色念珠菌进行药敏实验，实验步骤严格按照标准操作规程进行，在35℃的有氧环境中培养24个小时，最后判读药敏结果并进行记录。氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑分别是所采用的3种抗真菌药。
　　选取白色念珠菌保守基因序列SAP6作为目的基因进行检测，并根据GenBank公布的白色念珠菌SAP6基因序列，应用Primer5.进行0软件设计白色念珠菌SAP6基因的PCR引物，对目的基因扩增，将PCR产物纯化并进行测序，将测序结果与SAP6基因对比，序列相同者认为是白色念珠菌。
　　用以对照的标准的白色念珠菌ERG11基因序列以GenBank的公布为准，通过Primer5.0软件对白色念珠菌ERG11基因的PCR引物开展设计，经目的基因的扩增后，此后可对PCR产物进行纯化操作，此后进行基因的测序工作。基因测序的结果在Blast分析软件中进行，该软件导出的基因序列与标准得到白色念珠菌ERG11基因标准序列X13296进行比对和分析，最终确定是否有基因突变位点的产生。
　　结果：
　　1．收集到符合标准的念珠菌有57株，鉴定菌株种类以白色念珠菌为主，共32株，占56.1％；光滑念珠菌紧随其后，为12株，占到了21.1%；热带念珠菌8株，占到了14.0%；克柔念珠菌则只有3株，占到了5.3%；其他念珠菌仅为2株，只占到3.5%。
　　2．通过32株白色念珠菌进行体外药敏实验可以发现：白色念珠菌共32株，其中有4株对氟康唑有耐药性，共有7株对伊曲康唑有耐药性，而仅有2株对伏立康唑有耐药性。
　　3．对32株白色念珠菌进行SAP6基因扩增并测序，所有白色念珠菌都检测出了SAP6基因。
　　4．经过实验分析32株白色念珠菌的ERG11基因测序结果，并将其与标准的X13296序列进行比对分析，结果发现：碱基突变位点共有37处，其中错义突变则共9处有发现。敏感菌株有3株出现错义突变，9株耐药菌株中存在1~5处错义突变。此次试验发现了白色念珠菌ERG11基因错义突变及氨基酸改变，其中敏感菌株的错义突变有T945A、G1309A、A530C，与此相对应的氨基酸突变分别为 D116E、V437I、K128T，耐药菌株则分别 T495A、A530C、T541C、G622A、G979A、A945C、G1309A、G1496A、G1728T，对应的氨基酸突变分别为D116E、K128T、Y132H、V159I、E226D、D278N、V437I、G450E、M527I。
　　结论：
　　通过对白色念珠菌ERG11基因测序，发现耐三唑类抗真菌药物的白色念珠菌多有ERG11基因突变，白色念珠菌ERG11基因突变导致D116E、V437I、K128T氨基酸改变，与白色念珠菌对三唑类抗真菌药物耐药性无关；D226E、G450E、Y132H氨基酸改变与白色念珠菌对三唑类抗真菌药物耐药性有关；V159I、D278N、M527I氨基酸改变与白色念珠菌对三唑类抗真菌药物耐药性关系需要进一步研究。多位点错义突变可产生协同作用，使得耐药性增加或交叉耐药。一些耐三唑类抗真菌药物的白色念珠菌ERG11基因未发现有意义的氨基酸改变，考虑有其他机制参与其耐药。

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缩略词表

1 引言

2 材料与方法

2.1 菌株收集

2.2 试验仪器

2.3 试验试剂

2.4 主要试剂的配制

2.5 菌悬液的制备

2.6 菌种形态学的鉴定

2.7 酵母菌鉴定

2.8 体外药敏试验

2.9 真菌DNA提取

2.10 提取的DNA溶液的纯度检测

2.11 白色念珠菌SAP6基因检测

2.12 ERG11基因检测

3 结果

3.1 肺部念珠菌感染的菌株分布

3.2 白色念珠菌体外药敏实验结果

3.3 提取的DNA溶液的纯度检测结果

3.4 白色念珠菌SAP6及ITS基因PCR产物电泳结果

3.5 白色念珠菌SAP6及ITS基因测序结果

3.6 白色念珠菌ERG11基因PCR产物电泳结果

3.7 白色念珠菌ERG11基因PCR产物回收电泳结果

3.8 ERG11基因测序结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述:常用抗深部真菌感染药物及其耐药机制

个人简历及研究生期间发表论文情况

致谢