志贺菌、大肠杆菌和沙门菌CRISPR结构特征生物信息学分析

摘要

志贺菌、大肠杆菌和沙门菌均是肠道性疾病的病原体，对人类的身体健康产生严重影响，并且对家庭以及社会造成比较严重的经济负担。细菌通过自身基因突变和获得外源性耐药基因产生耐药性，耐药基因的水平转移使得细菌更能产生广泛的耐药性。成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是细菌获得性免疫的一个机制，其可以获得外源性基因从而抵抗外来遗传元素。
　　目的:
　　提取志贺菌、大肠杆菌和沙门菌数据库中的CRISPR序列，阐述不同种属细菌CRISPR结构特征，描述分布规律，探索spacer序列的形成机制及意义，为进一步研究CRISPR/Cas机制以及特性提供参考。
　　方法:
　　1从CRISPRdb获得7株志贺菌、52株大肠杆菌和39株沙门菌的CRISPR相关信息，从GenBank中获得107株志贺菌基因组序列；12株实验室保存志贺菌和33个临床分离志贺菌CRISPR的spacer也纳入此次研究。
　　2利用多序列比对分析志贺菌、大肠杆菌和沙门菌 CRISPR结构特征，利用Weblogo、RNAfold分析CRISPR中的重复序列，并用DNAMAN构建cas1和cas2基因同源树；利用CRISPRTarget及BLAST对spacer序列进行分析。
　　结果:
　　1志贺菌、大肠杆菌及沙门菌存在的 CRISPR相似，志贺菌中存在的有CRISPR1/2（CRISPR1、CRISPR2）和CRISPR3；大肠杆菌中不仅有CRISPR1/2和CRISPR3/4（CRISPR3、CRISPR4），还发现有新的CRISPR，命名为CRISPR5/6（CRISPR5、CRISPR6）；沙门菌中主要存在的是CRISPR1/2，同样也发现了新的CRISPR（命名为CRISPR5/6）。
　　2对于大肠杆菌和沙门菌，CRISPR1/2的上游侧翼序列序列一致性分别为69.5％（34株）、93.5%（35株），下游为92.3%（32株）、91.4%（32株），在CRISPR1的下游和CRISPR2的上游侧翼序列分为2或3个组，CRISPR3/4和CRISPR5/6有相似的特点。不同位置CRISPR中的unique spacer所占的比例不同， CRISPR1/2和 CRISPR5/6在沙门菌分别为33.6%和68.6%， CRISPR1/2、CRISPR3/4和CRISPR5/6在大肠杆菌分别为54.3%、47.4%和68.6%。
　　3分析GenBank中志贺菌时发现，某些CRISPR第一个和末端重复序列存在碱基的差异。不同志贺菌中cas基因簇会发生某些cas基因的缺失，在cas基因中也发现IS序列。志贺菌中的cas1和cas2基因均分为两个部分，其序列相似性不低于70%。志贺菌中CRISPR-Q1的spacer数目与CRISPR1/CRISPR2存在正相关。
　　4经过对spacer序列分析，其可分成3个类型，I型spacer匹配的是一个基因片段，可能是编码区、非编码区序列或是编码区与非编码区序列的结合；II型spacer可能匹配2个或多个基因片段，其可能是多个基因片段的拼接融合；III型是未定的。经过对spacer匹配基因编码产物分析，其包含有多种类型，有的是Cas蛋白，有的与细菌自身的生存有关，有的与本身结构相关，有的是功能性蛋白。
　　结论:
　　1.志贺菌、大肠杆菌和沙门菌中均存在CRISPR。
　　2.志贺菌、大肠杆菌和沙门菌不同位置CRISPR的侧翼序列序列一致性不同。
　　3.志贺菌不同CRISPR重复序列的保守性不同，cas基因簇的cas基因经常会发生变化。
　　4. Spacer序列存在多种形成机制，其匹配基因编码产物丰富，包含多种类型。

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英文摘要

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英文缩略词

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 技术路线图

3 结果

3.1 志贺菌、大肠杆菌和沙门菌中CRISPR的分布

3.2 志贺菌、大肠杆菌和沙门菌中CRISPR的结构特征

3.3 Spacer的形成方式及匹配基因编码产物特点

4 讨论

4.1 志贺菌、大肠杆菌和沙门菌中CRISPR的分布

4.2 志贺菌、大肠杆菌和沙门菌中CRISPR的结构特征

4.3 Spacer形成方式的探索及匹配基因编码产物特点

4.4 创新性及局限性

5 结论

参考文献

综述： 利用生物信息学方法研究CRISPR系统结构

1 CRISPR系统结构

2 CRISPR的生物信息学

3 大肠杆菌存在的CRISPR系统的分析

4 CRISPR与耐药和毒力之间的联系

5 总结与展望

参考文献

附录

个人简历

致谢