CD11c+HLADR+树突状细胞及相关因子在OHSS患者卵泡液中的变化及对早期胚胎发育的影响

摘要

第一部分：CD11c+HLADR+树突状细胞及相关细胞因子、雌孕激素、VEGF在OHSS患者卵泡液中的表达
　　研究目的：
　　通过研究卵巢过度刺激（OHSS）患者卵泡液中CD11c+HLADR+树突状细胞及相关细胞因子以及VEGF和雌孕激素的分布和表达情况及其之间的相互关系，探讨OHSS患者卵泡液微环境的免疫状态，并试图从免疫学角度探讨OHSS发生的机制并为其治疗提供依据。
　　研究方法：
　　统计分析OHSS组和对照组患者基本情况及两组胚胎发育情况；运用流式细胞仪检测OHSS患者和对照组患者卵泡液中CD11c+HLADR+树突状细胞的分布情况；运用ELISA的方法检测两组患者卵泡液中VEGF及与树突状细胞相关的细胞因子IL-10、IL-12、IL-18和IL-23的表达情况；运用电化学发光法检测两组患者HCG日血清及取卵日卵泡液中雌激素和孕激素的表达情况，分析HCG日血清雌激素和孕激素及取卵日卵泡液中VEGF与HLA-DR的相关性。
　　结果：
　　1. OHSS组与对照组相比，二者年龄及不孕年限无明显差异，在基础内分泌方面，OHSS组FSH低于对照组（P<0.05），而LH和P高于对照组（P<0.05）。OHSS组获卵数显著高于对照组（P<0.05），而正常受精率、优质胚胎率和胚胎利用率均显著低于对照组（P<0.05）。
　　2. OHSS组和对照组患者卵泡液中CD11c+HLADR+树突状细胞分别为18.68％±2.2%和13.32%±1.6%，OHSS组患者卵泡液内CD11c+HLADR+树突状细胞显著高于对照组（P<0.05）。
　　3. HCG日血清及取卵日卵泡液内OHSS组雌激素及孕激素水平显著高于对照组（P<0.05）。
　　4.取卵日OHSS组患者卵泡液内IL-10、IL-12、IL-18、IL-23及VEGF的表达水平均显著高于对照组（P<0.05）。
　　5. HCG日OHSS组血清雌激素及孕激素水平均与HLADR平均荧光强度成正相关（r=0.74，0.34）；HCG日对照组血清雌激素及孕激素水平也分别与HLA-DR平均荧光强度成正相关（r=0.85，0.61）；取卵日OHSS组和对照组卵泡液VEGF分别与HLADR平均荧光强度成正相关（r=0.80，0.74）。
　　结论：
　　1. OHSS患者卵泡液内CD11c+HLADR+树突状细胞量及其相关的细胞因子IL-10、IL-12、IL-18、IL-23均显著增高，提示OHSS患者卵泡液呈现一种免疫应答的状态，说明炎症反应参与了OHSS的发生。
　　2. VEGF在OHSS患者卵泡液中显著升高，并且与HLA-DR平均荧光强度成正相关，提示卵巢血管渗透性增加与卵巢炎症反应程度相关。
　　3. OHSS患者HCG日血清雌孕激素显著升高，并且与HLA-DR平均荧光强度成正相关，提示CD11c+HLADR+树突状细胞参与了排卵过程中雌孕激素生成的监管。
　　4. OHSS组血清雌孕激素水平以及取卵日卵泡液雌孕激素水平均显著增高，雌、孕激素水平均可作为预测OHSS发生的有效指标，并间接反应卵子质量。
　　5. OHSS患者卵泡液微环境免疫状态的改变可能会影响卵子质量和胚胎的早期发育。
　　第二部分：雌激素、孕激素、VEGF对树突状细胞相关细胞因子的调节
　　研究目的：
　　体外分化培养CD11c+HLADR+树突状细胞，并用不同浓度雌激素、孕激素以及VEGF刺激树突状细胞，从mRNA水平上探讨三者对树突状细胞合成相关细胞因子的影响。
　　研究方法：
　　从人外周血中分化培养 CD11c+HLADR+树突状细胞；用高、中、低三种不同浓度雌激素、孕激素及VEGF分别刺激CD11c+HLADR+树突状细胞，并用qPCR的方法检测IL-10、IL-12、IL-18、IL-23、TNF-α的基因表达情况；运用ELISA方法检测细胞上清液中IL-10、IL-12、IL-18、IL-23及TNF-α的表达情况。
　　结果：
　　1.在诱导培养的第7天，可见典型树突状细胞；经双标方法流式细胞术检测， CD11c+HLADR+树突状细胞的双阳性率在76.85%左右。
　　2.用高浓度E2刺激树突状细胞，结果IL-10、IL-12、IL-18、IL-23及TNF-α与对照组相比基因表达均显著上调（P<0.05）；用中、低浓度E2刺激树突状细胞，结果TNF-α与对照组相比基因表达显著上调（P<0.05）。
　　3.用高浓度P刺激树突状细胞，结果IL-12与对照组相比基因表达上调，且有统计学差异（P<0.05）；用中浓度P刺激树突状细胞， IL-10、IL-12与对照组相比基因表达显著上调（P<0.05）；用低浓度P刺激树突状细胞，结果IL-18、IL-23与对照组相比基因表达上调并且有统计学差异（P<0.05），而TNF-α与对照组相比基因表达下调并且有统计学差异（P<0.05）。
　　4.用高浓度VEGF刺激树突状细胞，结果IL-12及TNF-α与对照组相比基因表达均上调，且有统计学差异（P<0.05）；用中浓度VEGF刺激树突状细胞，结果TNF-α与对照组相比基因表达上调且有统计学差异（P<0.05）。
　　5. ELISA结果显示，高浓度E2、P、VEGF刺激树突状细胞后，细胞培养上清液IL-10、IL-12、IL-18、IL-23及TNF-α与对照组相比均升高且有显著性统计学差异（P<0.01），用中、低浓度VEGF刺激树突状细胞后，结果细胞培养上清液IL-10、IL-12、IL-23及TNF-α与对照组相比量均升高且有统计学差异（P<0.05）。
　　结论：
　　1.从人外周血中分化培养CD11c+HLADR+树突状细胞是可行的获取树突状细胞的方法。
　　2.高浓度的雌激素通过作用于树突状细胞可显著上调IL-10、IL-12、IL-18、IL-23的表达，使免疫反应偏向TH1型，加重炎症反应的发生。
　　3.高浓度的孕激素也使免疫反应偏向TH1型，与雌激素一起共同加重炎症反应的发生。由此可推测在OHSS患者卵泡液内，高浓度的雌激素和孕激素可加重卵泡微环境的炎症反应的发生。
　　4.高浓度VEGF刺激树突状细胞，IL-12和TNF-α基因表达上调；中浓度VEGF刺激树突状细胞，上调TNF-α基因表达；VEGF可通过对树突状细胞的作用促进一些炎症因子的分泌，引起炎症的级联放大作用，由此可见高浓度VEGF可通过刺激树突状细胞加重OHSS的病理生理过程。
　　5.高浓度雌激素、孕激素、VEGF均可通过对树突状细胞的作用引起IL-12基因表达的上调，加重炎症的发生。
　　第三部分雌激素、孕激素、VEGF与树突状细胞作用后的上清液对胚胎发育的影响
　　研究目的：
　　通过在胚胎体外培养体系里加E2、P、VEGF与树突状细胞作用后的上清液来部分模拟OHSS患者卵泡液微环境，并应用time-1apse延时摄像技术结合胚胎评分系统观察早期胚胎发育的情况，从而探讨 OHSS患者卵泡液微环境对胚胎早期发育的影响。
　　研究方法：
　　以复苏后的3PN合子作为研究对象，将不同浓度E2、P、VEGF与树突状细胞培养后的上清液及单纯的E2、P、VEGF和未加任何刺激物的树突状细胞上清液分别加入胚胎培养液中，共分为14组，应用time-1apse延时摄像技术并结合胚胎评分系统观察早期胚胎发育的情况，并比较各组胚胎卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、胚胎累积评分、第一次细胞分裂时间、第3次细胞分裂开始至第4次细胞分裂开始的时间间隔（s2）、1细胞发育到5细胞的时间间隔（t5）及胚胎发育过程中不良事件的发生率（不均、空泡、碎片和胚胎发育阻滞发生率）。
　　结果：
　　1.本研究共冷冻688枚3PN合子，复苏681枚，解冻复苏率为：98.9%（681/688）。
　　2.不同浓度E2、P、VEGF与树突状细胞作用后上清液培养胚胎结果优质胚胎率、胚胎累积评分均显著低于对照组（P<0.05），而在囊胚形成率方面各组无明显差异。高浓度P及低浓度VEGF与树突状细胞作用后的上清液培养胚胎结果3PN卵裂率与对照组相比显著下降（P<0.05）。分别在培养液中添加单纯E2、P及树突状细胞结果优质胚胎率、胚胎累积评分均显著低于对照组（P<0.05）。高浓度E2、P与树突状细胞作用后的上清液培养胚胎结果胚胎累积评分显著低于低浓度E2、P与树突状细胞作用后的培养结果（P<0.05）。
　　3.对照组第一次细胞分裂时间为26.68±2.67小时，所有实验组与之相比均延长，且有统计学差异（P<0.05）；与对照组相比，高、中、低浓度E2、P、VEGF组s2均延长，且有统计学差异（P<0.05），与单纯树突状细胞组比较，高、中、低浓度E2组及高、中浓度P和VEGF组s2均延长，且有统计学差异（P<0.05）；与对照组及单纯树突状细胞组相比，高浓度E2、P组及高中浓度VEGF组t5显著延长（P<0.05）；所有组卵裂模式与对照组相比无明显差异。
　　4.与对照组比较，高、中、低浓度E2与树突状细胞培养后的上清液及单纯E2组使胚胎不均发生率及碎片发生率均升高（P<0.05），高浓度E2与树突状细胞培养后的上清液组还使胚胎空泡发生率及胚胎发育阻滞发生率升高（P<0.05）。
　　5.高、中、低浓度P与树突状细胞培养后的上清液及单纯P组使胚胎不均发生率、空泡发生率及碎片发生率均升高（P<0.05），高浓度P与树突状细胞培养后的上清液组还使胚胎发育阻滞发生率升高（P<0.05）。
　　6.高、中、低浓度VEGF组使胚胎不均发生率升高（P<0.05），高、中浓度VEGF组及单纯VEGF组使胚胎碎片发生率升高（P<0.05），高浓度VEGF组及单纯VEGF组使胚胎空泡发生率增加（P<0.05）。
　　结论：
　　1.3PN受精卵的解冻复苏率高，可以用来作为实验研究对象来评估早期胚胎发育；
　　2. E2、P、VEGF与树突状细胞作用后的上清液对胚胎进行培养会引起优质胚胎率和胚胎累积评分的下降，可能与E2、P、VEGF与树突状细胞作用后引起炎症因子的改变从而改变胚胎周围的免疫环境有关。
　　3. Time-lapse可以对胚胎第一次细胞分裂时间、s2、t5进行动态观察，高浓度E2、P、VEGF与树突状细胞作用后的上清液更加有损胚胎的发育潜能，但并不影响胚胎的卵裂模式，由此可以推断 OHSS患者胚胎质量下降可能与高浓度的E2、P、VEGF与树突状细胞的作用有关。
　　4.高浓度的 E2、P、VEGF与树突状细胞作用后的上清液均使胚胎不均、空泡、碎片及胚胎发育阻滞的发生比率均增加，结合第二部分实验结果高浓度的E2、P、VEGF与树突状细胞作用后的共同点是使IL-12基因表达上调，由此可知IL-12基因表达上调可能与这些不良事件的发生相关。

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中英文缩略词表

前言

第一部分 CD11c+HLADR+树突状细胞及相关细胞因子、雌孕激素、VEGF在OHSS患者卵泡液中的表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 雌激素、孕激素、VEGF对树突状细胞相关细胞因子的调节

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三部分 雌激素、孕激素、VEGF与树突状细胞作用后的上清液对胚胎发育的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文小结

本文创新

综述:树突状细胞功能及在辅助生殖技术中的作用

个人简历

致谢