不同药物对NH4Cl诱导的肝细胞模型能量代谢影响

摘要

背景：
　　肝脏是人体葡萄糖、脂类、蛋白质、维生素和激素等物质代谢的重要器官，在人体生物转化、解毒、代谢、消化、分泌、排泄和免疫过程中起着至关重要的作用。当肝脏功能受损，“残存”的肝细胞不能满足机体代谢需要时，导致机体代谢紊乱，例如乳酸中毒、血氨及吲哚水平升高等。慢加急性肝衰竭（ACLF）指在慢性肝脏疾病情况下，肝脏功能在短期（2-4周）内出现严重受损，丧失其合成及解毒功能，从而导致黄疸、肝性脑病、凝血功能障碍和继发多器官功能衰竭的一组临床症候群[1]。其发病急，病情重，治疗难度大，死亡率高[2]。目前认为血氨增高与慢加急性肝衰竭最主要的并发症--肝性脑病的发生密切相关[3]。
　　血氨由机体组织中各种氨基酸分解代谢产生的氨以及由肠管吸收进来的氨进入血液而形成，目前认为血氨主要在肝脏经鸟氨酸循环代谢成无毒的尿素排出体外[4]。慢加急性肝衰竭时，肝脏将氨合成为尿素的能力减退，引起血氨增高。升高的血氨可引起脑星形胶质细胞肿胀、神经递质合成及释放障碍、增加氧化应激等，增加肝性脑病、脑水肿、脑疝、癫痫等疾病的发生率，从而影响患者预后[5]。由于动脉血氨水平升高，肝衰竭患者会发生大脑能量代谢紊乱，包括糖酵解、三羧酸循环及氧化呼吸电子链等过程，从而导致能量缺失。Bhatia等的研究表明，动脉血氨浓度>124umol/L与重型肝性脑病和脑水肿的发生有关[6]。一般认为血氨升高仅仅与肝性脑病相关，尚无证据表明血氨能对肝细胞产生直接或间接影响，但本课题组的研究表明，血氨对肝细胞产生的影响远比我们想象的多。
　　众所周知，在慢加急性肝衰竭中，大量肝细胞坏死，残存的肝细胞功能维持是非肝移植患者生存和救治的希望，因此如何更好维护“残存”肝细胞的功能，改善肝细胞能量供应、减轻线粒体损伤，也是目前肝衰竭支持治疗重要的研究课题。我们前期研究的结果提示：肝衰竭引起的血氨升高不单单会引起“肝性脑病”，还会造成肝细胞以凋亡形式为主的损伤，抑制肝细胞的再生。临床回顾性研究发现：早期、全程应用降血氨药物能够显著缓解患者肝脏损伤、降低患者死亡率、改善患者预后[7]。既往研究大多集中于氨对大脑细胞能量代谢的影响，而氨对肝细胞能量代谢的影响尚不清楚。本实验通过高氨细胞模型的建立，揭示氨在肝细胞能量代谢过程中的作用，同时对比左卡尼汀、复方二氯醋酸二异丙胺、曲美他嗪对高氨诱导的肝细胞能量代谢影响。
　　目的：
　　1.建立高氨肝细胞模型，检验氯化铵是否对肝细胞产生毒性
　　2.应用浓度梯度的氯化铵处理培养的人正常肝细胞 chang liver细胞，检测糖酵解及三羧酸循环过程中化合物、酶的水平的变化，从而阐述氨对肝细胞的能量代谢影响
　　3.用左卡尼汀、复方二氯醋酸二异丙胺、曲美他嗪对高氨处理的肝细胞进行干预，检测肝细胞生长状况及细胞内乳酸的变化。
　　方法：
　　氨中毒的细胞模型
　　1.CCK-8法检测氨及三种药物对肝细胞的毒性作用
　　2.ELISA法及生化自动分析仪检测细胞内糖酵解及三羧酸循环过程中乳酸、丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰COA的变化水平
　　结果
　　随氯化铵浓度的升高及作用时间的延长，氯化铵对 chang liver细胞的抑制率逐渐增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；随氯化铵浓度的增加，细胞内丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶含量升高，而丙酮酸脱氢酶、乙酰 COA的表达量降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；氯化铵可以引起细胞内乳酸升高，其中以5mM NH4Cl引起乳酸浓度最高；用5mM NH4Cl及左卡尼汀、复方二氯醋酸二异丙胺、曲美他嗪处理人肝细胞 Chang liver,左卡尼汀、复方二氯醋酸二异丙胺联合处理组细胞增殖情况较氯化铵处理组升高（P<0.05)，而曲美他嗪不能改善氯化铵引起的肝细胞生长抑制现象；此外，左卡尼汀联合处理组及复方二氯醋酸二异丙胺联合处理组乳酸水平较氯化铵单独处理组降低（P<0.05),其中左卡尼汀效果较好；而曲美他嗪联合处理组则升高（P<0.05)。
　　结论：
　　1.氯化铵对肝细胞生长具有抑制作用，且随浓度升高，抑制率增加。
　　2.氯化铵可以促进肝细胞糖酵解、抑制三羧酸循环。
　　3.左卡尼汀、复方二氯醋酸二异丙胺均可降低氯化铵引起的肝细胞乳酸升高及肝细胞生长抑制情况，而曲美他嗪不能改善氯化铵引起的肝细胞生长抑制现象，且可以升高乳酸水平。

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缩略词

前言

材料与方法

1．材料

1．1细胞的来源及培养方法

1．2主要试剂及配置方法

1．3主要仪器

2.方法

2．1 CCK-8法检测NH4Cl对肝细胞的毒性作用

2.2 NH4Cl处理肝细胞后乳酸及相关酶的含量

2.3 左卡尼汀、复方二氯醋酸二异丙胺、曲美他嗪对NH4Cl刺激下肝细胞能量代谢影响

3 统计学处理

4 结果

4.1氨对肝脏chang liver细胞的CCK-8结果

4.2 氨作用于chang liver细胞后乳酸表达量

4.3氨作用于chang liver细胞后丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰COA表达量

4.4 CCK8-法检测左卡尼汀、复方二氯醋酸二异丙胺、曲美他嗪对5mM NH4Cl处理后的肝细胞细胞增殖情况

4.5左卡尼汀、复方二氯醋酸二异丙胺、曲美他嗪对5mM NH4Cl处理后的肝细胞乳酸含量影响

讨论

结论

参考文献

综述部分: 高血氨对大脑能量代谢影响机制

个人简历及在学期间发表的学术论文及研究成果