MACF1在胃癌中的表达及CRISPR/Cas9敲除MACF1对胃癌体外生物学行为的影响

摘要

胃癌(gastric cancer, GC)是全球死亡率第二位的恶性肿瘤，胃癌的发病率高，治疗效果差，根治率低，在消化道肿瘤中发病率和死亡率占第一位，是危害人类健康的主要恶性肿瘤之一。
　　本研究拟探讨MACF1在胃癌中的表达情况及预后的关系，为胃癌的早期诊断和治疗提供理论依据。并采用CRISPR/Cas9基因打靶技术，敲除胃癌细胞系中的MACF1基因的表达，观察细胞生物学行为及功能的变化，从而研究MACF1在胃癌发生发展机制中的作用。
　　本研究主要分为以下三个部分:
　　第一部分：MACF1在胃癌中的表达情况及与临床预后之间的关系
　　目的：
　　探讨MACF1蛋白在胃癌组织中的表达情况及其与临床病理学特征和临床预后之间的关系
　　方法：
　　1.构建组织芯片并采用免疫组化法(IHC)检测MACF1在107例胃癌组织及107例相对应正常组织的胃癌上皮中的表达情况;
　　2.对所有患者进行随访，获得5年随访资料，并结合MACF1在胃癌上皮组织中的表达情况，分析MACF1表达与临床病理和预后之间的关系;
　　3.免疫组化结果分析和判定:每张芯片免疫组化结果均由3位病理科医师进行双盲评价，芯片上的每个点评价至少5个高倍视野，每个高倍视野下的细胞不应少于100个。然后根据免疫组化的着色强度和着色范围进行综合评价。
　　4.统计学处理:应用SPSS21.0统计分析软件对所得实验数据进行处理。采用Spearman相关分析进行有序变量之间的联系的分析，采用Pearson's卡方检验分类变量之间的比较;采用Kaplan-Meier法分析MACF1表达与胃癌患者生存预后之间的关系并绘制生存曲线，采用log-rank检验比较组间的差异;采用Cox风险模型进行多因素分析，评估各个指标对患者的预后生存的独立影响，包括患者的年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度、分期和淋巴结转移等等，从而分析与胃癌患者预后生存相关的独立危险因素。P＜0.05时有统计学差异，双侧检验。
　　结果：
　　1.免疫组化结果显示:在107例胃癌癌旁正常组织中，24例染色阳性(22.4％)，83例染色阴性(77.6％);107例胃癌组织中，76例染色阳性(71.0％)，31例染色阴性(29.0％)。MACF1蛋白在胃癌组织中的表达率为71％(76/107)，明显高于其相应的癌旁正常胃粘膜组织22.4％(24/107)，且差异具有统计学意义(p＜0.05);
　　2.MACF1过表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转和肿瘤分期密切相关，并有统计学意义(p＜0.05);
　　3.总体胃癌术后患者5年生存生存率42.5％(45/107)，MACF1蛋白表达升高的胃癌患者的5年生存率35.2％(25/76)明显低于MACF1蛋白低表达的胃癌患者的5年生存率55.6％(20/31)，且差异具有统计学意义(p=0.034);
　　4.MACF1的过表达、临床分期、淋巴结的转移个数都是胃癌患者术后总体生存率的独立预后因素。
　　第二部分：CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1基因改造胃癌细胞系
　　目的：
　　探讨MACF1在不同胃癌细胞系中的表达情况及并利用CRISPR/Cas9基因打靶技术靶向敲除MACF1以获得突变型胃癌细胞系。
　　方法：
　　1.采用荧光实时定量PCR(Q-PCR)和蛋白印迹(Western-blot)的方法检测MACF1在5个不同的胃癌细胞系AGS、HGC-27、SNU-1、KATO-Ⅲ、NCI-N87中的表达情况，筛选表达量较高的细胞系;
　　2.MACF1 CRISPR/Cas9载体构建:将MACF1的全基因组序列输入Vector NTI软件中，选定合适外显子并在Zifit工具网站中获取合适的sgRNA序列，并加入BsaⅠ酶切位点，CRISPR/Cas9及引导的sgRNA转染目的细胞后，Cas9在切割基因组的同时也会切割同样含有靶序列的质粒reporter，将sgRNA和reporter合成后，稀释退火，连接转化、挑菌、扩大培养，质粒提取;
　　3.通过转染EGFP绿色荧光蛋白，筛选转染质粒与Lip2000的最佳转染比例:质粒的质量与Lip2000体积比例分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，转染48小时后观察细胞转染情况，选取最佳转染比例;
　　4.使用Lip2000分别将sgRNA、reporter、cas9转染进JH293工具细胞，筛选切割效率较高的sgRNA;
　　5.使用Lip2000分别将切割效率较高的sgRNA、reporter、cas9转染进工具细胞目的细胞AGS、SNU-1，48小时后观察转染效率;
　　6.流式分选细胞仪分选目的细胞:将转染后细胞消化制备单细胞悬液，在流式细胞仪中分选单个目的细胞，种于96孔板中;
　　7.单克隆细胞的培养及细胞收集:培养1-2周后，观察96孔板中的单克隆细胞团，待96孔板中的细胞长至50％左右时，分至另一96孔板中。
　　结果：
　　1.Q-PCR和Western-blot结果显示: MACF1在5个不同的胃癌细胞系AGS、HGC-27、SNU-1、KATO-Ⅲ、NCI-N87等均有表达，且Q-PCR与WB二者结果基本一致，均为NCI-N87表达量最高，其次为AGS、SNU-1、HGC-27、KATO-Ⅲ;
　　2.成功构建MACF1 CRISPR/Cas9载体，共构建5个sgRNA、2个reporter，并转化、摇菌、扩大培养，提取质粒;
　　3.质粒与Lip2000最佳转染比例分别为:AGS1∶2、HGC-271∶2、SNU-11∶3、KATO-Ⅲ1∶3、NCI-N87的Lip2000转染效率极低;
　　4.JH293工具细胞筛选的sgRNA和reporter分别为reporter1、sgRNA2;
　　5.成功将sgRNA2和reporter1转染进入AGS和SNU-1，48小时后流式分选
　　6.流式分选AGS和SNU-1的单细胞悬液，种于96孔板中，每个细胞分别收集4个96孔板;
　　7.单克隆细胞团形成后，并长成96孔板的50％，分盘培养，AGS细胞平均单克隆形成率为19/96(19.79％)，SNU-1细胞平均单克隆形成率为25/96(25.78％)。AGS细胞存活率48.68％; SNU-1细胞存活率46.46％。
　　8.T7错配酶切鉴定:37个AGS细胞株有10个酶切鉴定结果为阳性，阳性率27％; SNU-1共验证8株，其中7个鉴定结果为阳性，阳性率为87.5％;将阳性的AGS和SNU-1全部送测序。
　　9.DNA测序并筛选AGS野生细胞系2株，纯合突变（正负）2株，杂合突变（负负）5株;SNU野生细胞系2株，一条染色体敲除细胞系2株，两条染色体同时敲除细胞系6株;
　　10.Western-blot验证得到的细胞株，MACF1基因纯合突变细胞系蛋白表达缺失，MACF1杂合突变细胞系蛋白表达较MACF1野生型减少。
　　第三部分：MACF1基因敲除对胃癌AGS细胞系体外生物学行为的影响
　　目的：
　　探讨CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1基因后对胃癌AGS细胞系生物学行为的影响。
　　方法：
　　1.MTS法检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞增殖能力的影响;
　　2.细胞划痕实验检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞的迁移能力的影响;
　　3.平板克隆检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞的克隆形成能力的影响;
　　4.软琼脂克隆形成检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞的克隆形成能力的影响;
　　5.Transwell实验检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞的迁移能力的影响;
　　6.流式细胞仪检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞周期的影响。
　　结果：
　　1.MACF1敲除后的胃癌AGS细胞形态变化，梭形变为类圆形;
　　2.MTS结果显示MACF1敲除后胃癌AGS细胞增殖能力减弱;
　　3.细胞划痕实验结果显示MACF1敲除后胃癌AGS细胞增殖能力减弱;
　　4.平板克隆形成实验结果显示MACF1敲除后胃癌细胞克隆形成能力减弱;
　　5.软琼脂克隆形成实验结果显示MACF1敲除后胃癌细胞克隆形成能力减弱;
　　6.Transwell结果显示MACF1敲除后胃癌AGS细胞的迁移能力减弱;
　　7.流式结果显示MACF1敲除后细胞阻滞在G2/M有丝分裂期。
　　结论：
　　1.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表达可以使胃癌细胞形态变化，细胞极性消失，形态由梭形变为类圆形，可能与MACF1蛋白参与细胞骨架形成有关;
　　2.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表达可以使胃癌细胞的增殖迁移和侵袭能力下降，可能与MACF1蛋白参与细胞间粘附有关;
　　3.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表达可以使细胞阻滞在G2/M期，即有丝分裂期，可能MACF1通过调节微丝微管的连接参与了细胞的有丝分裂。

目录

声明

摘要

中英文缩写词对照表

前言

参考文献

第一部分 MACF1在胃癌中的表达情况及与临床预后之间的关系

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二部分 CRISPR／Cas9靶向敲除MACF1基因改造胃癌细胞系

第一章 Q-PCR和Westernblot筛选高表达胃癌细胞系

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第二章 MACF1 CRISPR／Cas9质粒载体构建

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第三章 gRNA和Reporter质粒转染JH293细胞并筛选

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第四章 转染目的胃癌细胞并流式分选单克隆培养

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第五章 MACF1基因敲除成功的胃癌AGS／SNU-1细胞系的筛选及鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三部分 MACF1基因敲除对胃癌AGS细胞系体外生物学行为的影响

1 实验材料

1．1 实验仪器设备

1．2 实验试剂

2 实验方法

2．1 MTS法细胞增殖实验

2．2 细胞划痕实验

2．3 平板克隆形成实验

2．4 软琼脂克隆形成实验

2．5 Transwell细胞迁移实验

2．6 流式细胞仪检测细胞周期分布

3 实验结果

3．1 细胞形态学观察

3．2 MTS法细胞增殖实验

3．3 细胞划痕实验

3．4 细胞平板克隆实验

3．5 软琼脂克隆形成实验

3．6 Transwell细胞迁移实验

3．7 流式细胞周期分布

4 讨论

5 小结

参考文献

结论

综述一 MACF1及斑蛋白家族的结构功能和在疾病发生发展中的作用

综述二 CRISPR-Cas9基因靶向修饰技术

个人简历

攻读博士学位期间发表文章及参与课题

致谢