人脐带沃顿胶和（-）-epicatechin在脑外伤中神经保护和神经再生作用的实验研究

摘要

脑外伤（Traumatic brain injury，TBI)是由外力的出现对大脑引起的损伤，在世界范围内，脑外伤是致死或致残的主要病因之一，男性多发于女性，给社会带来越来越大的医疗、护理负担和经济负担。大脑中调控情绪和学习记忆的重要部位海马区位置表浅，有神经再生（neurogenesis）在此发生，容易在脑外伤中受损，其受损后将会带来一系列长期并且严重的后果。尽管随着对此疾病的诊断，治疗，护理以及后期康复训练等水平的提高，现在仍未发现一种行之有效的治疗方法进行神经保护和促进神经再生。因此，迫切需要探明脑外伤损伤后病理生理改变机制，从而获得一种修复神经损伤并改善神经功能，促进神经再生的治疗方法。本文拟用人脐带沃顿胶和(-)-epicatechin从不同途径治疗脑外伤，观察这两种治疗方式的治疗效果。
　　干细胞作为新型的一种治疗方式，被越来越广泛的应用在脑外伤的治疗之中。在众多不同种类的干细胞中，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stemcells，hUC-MSCs)具有很强的自我更新和分化能力，来源方便，便于收集，培养和运输等优点，同时应用此细胞治疗避免异种移植时机体的自我排斥的风险，没有道德争议。已有报道被用来治疗脑外伤，取得一定的治疗效果。能产生大量hUC-MSCs的脐带基质，沃顿胶（Wharton’s Jelly）组织中富含多种胶原成分和透明质酸，形成水凝胶结构，能够承受挤压、拉伸等外力，同时微环境结构具有支持细胞生长和充当组织支架，目前尚无有关于应用脐带沃顿胶治疗脑外伤的相关报道。因此，我们选择WJ组织治疗TBI，观察损伤大鼠的神经功能恢复，取得很好的治疗效果。
　　(-)-Epicatechin(EC)--黄烷醇(Flavanols)的一种，广泛存在于可可、红酒、茶、水果和蔬菜中，可激活体内的神经保护通路，从而改善机体氧化防御系统。EC被认为是通过激活转录因子Nrf2（Nuclear factor erythroid2-related factor2 Nrf2）信号通路发挥功能。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，通过结合抗氧化反应元件（Antioxidant response element，ARE），调控下游的抗氧化蛋白、蛋白酶体、II相解毒酶和分子伴侣等基因的转录和表达。我们前期研究发现，在小鼠脑出血模型中，EC激活Nrf2/ARE通路，起神经保护作用。在此实验中，运用EC治疗小鼠控制性皮层撞击脑外伤模型（Controlled cortical impact，CCI），发现EC可明显改善小鼠神经功能恢复，有神经保护和神经再生作用。
　　第一部分人脐带沃顿胶(Wharton’s Jelly)在脑外伤神经修复作用中的实验研究
　　目的：
　　建立改良自由落体脑外伤动物模型，探索人脐带沃顿胶移植是否促进大鼠脑外伤后神经功能的恢复。
　　方法：
　　应用SD大鼠，建立改良自由落体脑外伤动物模型。随机分为 Sham组，TBI+Vehicle组和TBI+WJ tissu组。脑外伤24小时后，进行WJ组织移植。观察脑外伤后1天至28天大鼠体重变化，mNSS评分变化。同时观察大鼠脑外伤后3天脑水含量的改变，28天时大脑损伤体和损伤周围神经元的存活情况，以及脑外伤后第14天不同组间BDNF蛋白和mRNA的表达和TBI后大鼠学习记忆功能（新物体识别实验和Morris水迷宫实验）的改变。
　　结果：
　　1. hUC-MSCs的鉴定流式细胞仪检测第3代的hUC-MSCs，结果显示：CD29和CD44呈高表达，CD34，CD133，HLA-DR(MHCII)和CD45均呈阴性表达。
　　2.动物模型成功构建本实验中，共使用98只大鼠，死亡2只。其中TBI+Veh组死亡1只，该组死亡率3.33％（1/33）；TBI+WJ tissue组死亡1只，该组死亡率3.33%（1/33）。
　　3. WJ组织治疗TBI减少脑损伤体积TBI后28天，HE染色，Sham组未见明显损伤，TBI+Veh组损伤体积为16.00±1.14mm3，高于TBI+WJ tissue组的12.10±1.28mm3，两组相比，p<0.05，有统计学差异。
　　4. WJ组织治疗TBI增加大鼠术后体重TBI后，大鼠体重在1天，3天减轻，从7天开始体重增加。TBI+Veh组和TBI+WJ tissue组1天，3天，7天，14天和21天各组体重无明显变化。28天时，TBI+WJ tissue组大鼠重量重于TBI+Vehicle治疗组（p<0.05）。
　　5. WJ组织治疗TBI减轻大脑水含量脑外伤可以显著增加大脑水含量，3天后，经WJ tissue治疗，和Vehicle治疗组相比，大鼠大脑水含量减少（p<0.05）。
　　6 WJ组织治疗TBI改善大鼠运动功能脑外伤21天和28天后，TBI+WJ tissue组mNSS评分低于TBI+Veh组（p<0.05）。
　　7 WJ组织治疗TBI改善大鼠认知功能脑外伤28天，在新物体识别实验中，Sham组的大鼠探索新物体时间明显多于旧物体。而在TBI+Veh组中，大鼠探索新、旧物体所用时间无明显统计学差异（p>0.05）。经 WJ组织治疗后，大鼠探索新物体时间多于探索旧物体所用时间（p<0.05）。相对于TBI+Veh组中的新物体的辨别指数，TBI+WJ tissue组辨别指数中明显增高（p<0.05）。在水迷宫实验中，TBI后26天到28天，TBI+Veh组中的大鼠在正确象限时间明显少于Sham组大鼠（p<0.05）。TBI后27天，28天，TBI+WJ tissue组中大鼠在正确象限时间，明显高于TBI+Veh组（p<0.05）。在TBI后第24天到28天，大鼠找到平台所用时间在TBI+Veh组明显多于Sham组（p<0.05）。经WJ组织治疗后，大鼠在TBI后27天和28天中找到平台所需时间明显少于TBI+Veh组（p<0.05）。
　　8. WJ组织治疗TBI增加BDNF蛋白和mRNA的表达脑外伤后14天，BDNF蛋白和mRNA的表达在 TBI+Veh组中有增高的趋势，但无统计学差异（p>0.05）。经WJ组织治疗后，和TBI+Veh组相比，BDNF蛋白和mRNA表达量明显增高（p<0.05）。
　　9. WJ组织治疗TBI增加损伤附近MAP-2阳性细胞数脑外伤后28天，在损伤区域附近，经 WJ组织治疗后，MAP-2阳性细胞数明显多于 TBI+Veh组（p<0.05）。
　　第二部分(-)-Epicatechin在脑外伤中神经保护和神经再生作用的实验研究
　　目的：
　　研究脑外伤后，(-)-epicatechin(EC)是否通过激活Nrf2/ARE通路发挥神经保护功能，是否能促进海马区神经再生。
　　方法：
　　使用控制性皮层撞击模型（Cortical impact model，CCI）模拟脑外伤的发生。在脑外伤后3h，开始口服EC，每天一次，短期观察给予3次EC，长期观察给予7次EC。我们通过大脑损伤体积，脑水肿，白质损伤，活性氧（reactive oxygen species，ROS）表达，运动功能评，认识能力和情绪障碍，以及 Nrf2相关蛋白表达等方面评价 EC的神经保护功能。Nrf2基因敲除小鼠被用来判定脑外伤后EC是否通过Nrf2/ARE通路起神经保护作用。用EdU显色，评价海马区神经再生情况。
　　结果：
　　1. EC治疗脑外伤改善小鼠短期运动功能同时减少大脑损伤体积脑外伤3天后，EC15mg/kg组降低脑损伤体积。同时改善从第1天到第3天的小鼠的运动功能（p<0.05）。其他剂量未能有如此效果，所以选择此剂量为治疗剂量。
　　2. EC长期治疗脑外伤减少大脑损伤体积，神经元变性坏死，改善神经功能恢复脑外伤后连续7天给予小鼠EC(15mg/kg)，28天后，EC减少脑外伤后大脑的损伤体积。同样，和Vehicle组对比，EC长期治疗后，改善脑外伤后1天，3天，7天，14天，21天和28天小鼠运动功能和认知功能（神经功能缺损评分，前肢放置实验，挂线实验、转棒实验、新物体识别实验）。EC治疗可增加小鼠的糖水偏嗜度并减少小鼠悬浮时间和不动时间，减轻抑郁症状(强迫游泳和悬尾实验)。脑外伤3天后，PI染色显示，大脑损伤周围区域坏死细胞由Vehicle组的164.58±9.64减少至EC治疗组的118.56±7.16（p<0.05)。FJB染色阳性细胞代表神经元变性坏死，相对于Vehicle组，在损伤区周围，EC治疗组有更少的FJB染色阳性细胞数（p<0.05）。脑外伤后28天，经EC治疗后，EC明显增多大脑左侧上半部皮层脑外伤后神经元存活个数(p<0.05)，具有神经保护功能。此外，脑外伤后3天，经EC治疗，损伤侧半球脑水含量由79.87±0.40%（Vehicle组）降为78.86±0.17%（p<0.05）。
　　3 EC治疗脑外伤减轻脑外伤后白质损伤我们用Luxol fast blue染色和MBP染色标记大脑白质中正常髓鞘。脑外伤28天后，EC治疗组Luxol fast blue和MBP染色阳性区域面积占总面积百分比明显高于Vehicle组（p<0.05）。
　　4 EC治疗脑外伤后减少ROS产生同时减轻MMP-9活性HEt染色被用来检测ROS的产生。脑外伤后3天，处死腹腔注射HEt的小鼠，统计分析荧光强度，结果显示，EC治疗脑外伤后ROS产生量明显低于Vehicle组（p<0.05)。经EC治疗后，脑外伤3天后，MMP-9活性相对于Vehicle组降低51%(p<0.05)。
　　5 EC治疗脑外伤后减少蛋白Keap-1表达同时增加细胞核内蛋白Nrf2表达脑外伤3天后，经EC治疗后，和Vehicle组相比，EC进一步降低Keap-1蛋白的表达量(p<0.05)。在胞质中，EC治疗脑外伤后，胞质Nrf2蛋白未见明显增多(p>0.05)，但相对于Vehicle治疗组，脑外伤3天后，EC增加Nrf2蛋白在细胞内的表达(p<0.05)。
　　6． EC治疗脑外伤增加SOD1和NQO1蛋白表达，降低HO-1蛋白表达和铁沉积，未减少大脑血红蛋白含量。脑外伤3天后，EC治疗组的SOD1和NQO1表达量进一步增加，明显高于Vehicle组(p<0.05)。相反的是，虽然脑外伤后，Vehicle组HO-1蛋白的表达量明显增高于Sham组经EC治疗，EC治疗组HO-1表达量低于Vehicle治疗组（p<0.05)。脑外伤3天后，检测脑组织血红蛋白含量，发现在EC治疗组和Vehicle治疗组的脑中血红蛋白含量无明显差异(p>0.05)。检测脑外伤后3天，脑损伤附近铁沉积情况，结果显示，对比于Vehicle治疗组，EC显著减少损伤周围铁沉积(p<0.05)。
　　7. EC治疗脑外伤促进海马SGZ区神经再生脑外伤后3天，EC治疗组EdU阳性细胞数和Ki67阳性细胞数明显多于Vehicle治疗组（p<0.05)。
　　8． EC治疗Nrf2基因敲出小鼠脑外伤未明显减少脑损伤体积和未明显改善神经功能恢复为验证EC是否在脑外伤后通过Nrf2通路起神经保护作用，我们建立Nrf2基因敲出小鼠CCI模型，观察EC治疗效果。脑外伤28天后，Vehicle治疗组的Nrf2基因敲出小鼠和EC治疗组的大脑损伤体积无明显差异(p>0.05)。神经功能缺损评分实验中，脑外伤后3天，7天，14天和28天，经EC治疗的Nrf2基因敲出小鼠评分低于Vehicle治疗组(p<0.05)。Nrf2基因敲出小鼠脑外伤后，在前肢放置实验和挂线实验中，在EC治疗组和Vehicle治疗组的小鼠未见明显差异(p>0.05)。在转棒实验中，EC治疗组的Nrf2基因敲出小鼠的坠落时间在第3天长于Vehicle治疗组（p<0.05)，但是在其它时间点，两组之间未见明显差异(p>0.05)。脑外伤28天，Nrf2基因敲出小鼠在新物体识别实验和糖水偏嗜实验中，EC治疗组和Vehicle治疗组实验结果未见明显差异(p>0.05)。此外，在悬尾实验和强迫游泳实验中，脑外伤后，脑外伤增加小鼠的不动时间和悬浮时间（Vehicle组VS Sham组，p>0.05)，而经EC治疗后，Nrf2基因敲出小鼠的不动时间和悬浮时间在EC治疗组和Vehicle治疗组未见明显差异（p>0.05)。
　　结论：
　　脑外伤后，用脐带沃顿胶治疗，可以改善运动功能和认知功能，同时促进BDNF表达，保护神经元的缺失，具有神经保护作用。
　　脑外伤后，EC可以激活 Nrf2/ARE通路，发挥神经保护作用，促进神经再生。同时也可能激活非依赖Nrf2通路，减少HO-1表达和损伤周围铁离子沉积。

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符号说明

引言

第一部分：人脐带沃顿胶(Wharton’s Jelly)对脑外伤修复的研究

引言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 附图

参考文献

第二部分：(-)-Epicatechin在脑外伤中的神经保护和神经再生的作用研究

引言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 附图

参考文献

全文结论

综述: 脑外伤后促进神经再生恢复神经功能的途径

个人简历及在学期间发表的学术论文

致谢