LSD1小分子抑制剂的发现及其抑制胃癌细胞转移侵袭机制研究

摘要

胃癌是世界上发病率前五的癌症之一，在致死的癌症中排第二。胃癌在亚洲发病率高，男性的发病率是女性的两倍，5年生存率低于30％。这样说来，探索胃癌发生发展的过程和转移侵袭的分子学机制的研究十分必要，可以为胃癌的临床的诊断和治疗提供理论基础。
　　在不同的细胞过程中，组蛋白的翻译后修饰在调控基因表达方面扮演重要角色，因为它直接影响染色质结构，进而影响了相关的病理生理条件。组蛋白的甲基化修饰一直被认为是静态的和不可逆的，直到2004年施杨教授发现组蛋白去甲基化酶。组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1（Lysine specific histone demethylase1）是首个组蛋白去甲基化酶，它的功能是去除组蛋白赖氨酸上的甲基，因而调控了在癌症进程中许多相关基因的表达。LSD1在多种肿瘤中高表达，用抑制剂或RNAi抑制LSD1活性或者降低其表达可以抑制肿瘤的生长，所以，筛选并且获得高选择性的小分子LSD1抑制剂是肿瘤治疗的研究热点。肿瘤细胞的转移是使癌症致死的重要原因，胃癌的特点是高转移和侵袭。所以，探索癌症细胞转移侵袭的分子学机制十分必要。有文献报道，组蛋白甲基化与癌症转移侵袭相关基因表达相关。然而，在胃癌细胞中，LSD1与转移侵袭的分子学机制仍然不清楚。
　　本课题评价了一类结构新颖的含氨基硫脲、端炔结构单元的5-氰基-6-苯基嘧啶类化合物对LSD1活性，获得了高选择性的小分子LSD1抑制剂，并且探索了该化合物在重组蛋白水平的分子学机制，深入探索了化合物对MGC803的EMT过程的影响，以及LSD1对TGFβ1调控的机制研究。
　　1）化合物对LSD1活性评价以及蛋白水平对LSD1活性调控机制
　　前期LSD1抑制剂筛选采用荧光方法，不需要洗涤或者转移溶液，在同一介质中混匀和测量的特点使得这种方法简单、便宜。然而，由于化合物本身基团的荧光的干扰使得该方法产生假阳性结果。AlphaScreen是一项通用的实验技术，使用同一介质检测分析物。这项技术是一个微珠-微珠靠近的实验。Donor beads产生的单氧分子可以到达 Acceptor beads，这个过程能够激发化学反应，最后检测生成化学信号。
　　LSD1的活性和对底物特异性是被与LSD1相互作用的蛋白所调控的。CoREST是一个重要的与LSD1结合的蛋白，辅助LSD1与核小体结合并去除组蛋白的甲基。本课题已经完成了截短体的CoREST蛋白在大肠杆菌中的表达纯化。
　　评价了5-氰基-6-苯基嘧啶类化合物对LSD1的活性，通过对化合物进行构效关系分析，发现了一类新颖结构的LSD1的小分子抑制剂。化合物6b的活性最好，IC50为0.65μM。因此，以下研究的主要研究对象是化合物6b。
　　在重组蛋白水平，化合物6b抑制LSD1活性，但是对MAO家族的活性很弱。因此，实验结果证实化合物6b对 LSD1具有选择性。时间依赖实验结果表明酶与化合物孵育的前8min内，不同浓度的化合物的抑制率表现出时间依赖。BLI检测化合物6b与LSD1结合类型和键的强弱，实验结果为化合物6b与LSD1非共价键结合，Kd为3.7μM。因此，这些实验结果阐释化合物6b与LSD1可能是紧密的可逆的结合。
　　2）化合物6b抑制MGC803转移侵袭的分子学机制研究
　　划痕实验和transwell小室实验的结果表明，化合物6b能够浓度依赖的抑制MGC803的转移和侵袭。Western blot实验结果证实，化合物6b能够浓度依赖的上调E-cadherin蛋白的表达，降低N-cadherin蛋白的表达，从而抑制了MGC803细胞的EMT过程。化合物6b可抑制 MGC803中 TGFβ1表达。同时构建pLVX-shRNA1-LSD1载体并将此载体转染入 MGC803中，上清用Elisa检测TGF-β1的表达量，实验结果表明LSD1表达量降低后，细胞分泌的TGFβ1量减少。即在MGC803中，LSD1能够促进TGFβ1的表达。ChIP实验表明TGFβ1基因被LSD1直接调控。因此推测在MGC803中，化合物6b抑制LSD1活性后，减少TGFβ1蛋白的表达，抑制细胞的EMT过程，进而影响细胞的转移和侵袭。

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第一章 前言

1.1 表观遗传学

1.2 组蛋白甲基化和去甲基化

1.3 LSD1

1.4 CoREST

1.5 EMT的分子机制

1.6 EMT和TGFβ通路

1.7 本论文的主要研究目的和内容

参考文献

第二章LSD1抑制剂筛选及其在蛋白水平作用机制研究

2.1基于化学发光方法的LSD1抑制剂筛选模型的建立

2.2基于Alphascreen的LSD1抑制剂筛选模型的建立

2.3 CoREST蛋白的表达纯化

2.4新型LSD1抑制剂蛋白水平选择性及其作用机制研究

第三章 新型LSD1抑制剂对胃癌细胞系MGC803转移和侵袭作用机制研究

3.1 LSD1小分子抑制剂抑制MGC803的转移和侵袭

3.2 新型LSD1抑制剂抑制肿瘤细胞上皮-间质转化

3.3新型LSD1抑制剂抑制MGC803中TGFβ1的表达

3.4 LSD1活性下调抑制TGFβ1诱导的EMT过程

3.5 MGC803中LSD1对TGFβ1调控机制研究

小结

结论

个人简历、在学期间发表的学术论文

致谢