rhMG53联合hUC-MSCs移植对阿尔茨海默鼠的治疗作用

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是与年龄密切相关的神经退行性疾病，随着我国社会的老龄化，AD患者呈现逐年上升趋势。当前，AD的发病机制的阐明和治疗手段的改进仍然是医学界的难题，干细胞移植治疗作为新的疾病治疗方案，为AD的治疗带来了希望。提高移植治疗的干细胞的生存能力，促进更多的干细胞迁移到脑组织发挥作用，对于提高干细胞移植治疗效果具有重要作用。MG53蛋白(Mitsugumin53 protein)是一种新发现的TRIM家族肌特异性蛋白，在细胞膜损伤修复和多种急性器官损伤保护中发挥关键作用。但是重组人MG53蛋白(recombinant human Mitsugumin53 protein，rhMG53)对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)氧化损伤和AD慢性病理状态下的保护作用未见报道。
　　目的:体外实验建立hUC-MSCs的H2O2氧化损伤模型研究rhMG53对hUC-MSCs氧化损伤的保护作用。体内实验研究rhMG53联合hUC-MSCs移植对APP+转基因模型鼠的干预和治疗作用，为进一步了解MG53蛋白的功能并探讨对hUC-MSCs保护和对AD的治疗作用提供科学依据。
　　方法:
　　1、体外实验研究rhMG53对hUC-MSCs氧化损伤的保护作用
　　使用组织块培养法从健康人脐带分离培养hUC-MSCs，P3代细胞建立H2O2损伤模型；CCK-8法检测rhMG53蛋白对细胞增殖的影响，筛选合适处理条件，确定实验分组为NC组，rhMG53组，H2O2组，预处理rhMG53组(Pre组)；Transwell小室观察rhMG53蛋白对细胞迁移的影响；流式细胞术检测rhMG53蛋白对细胞周期和细胞凋亡的影响；β-半乳糖苷酶染色检测rhMG53蛋白对细胞衰老的影响；分光光度法检测rhMG53蛋白对细胞SOD活性和MDA含量的影响。
　　2、体内实验研究rhMG53联合hUC-MSCs移植对阿尔茨海默鼠的治疗作用
　　使用4月龄APP+转基因阿尔茨海默病模型鼠，分为APP+组，hUC-MSCs组，rhMG53组，rhMG53联合hUC-MSCs组(联合组)；一周后，免疫组化检测小鼠脑内hUC-MSCs移植的迁移率；两周后，用跑步机检测小鼠的运动能力；四周后，Morris水迷宫检测各组小鼠的学习和记忆能力；分光光度法检测各组小鼠血清SOD的活性和MDA的含量；qRT-PCR和Western blot检测各组小鼠脑组织中衰老相关基因(Sirt1、Sirt2、PCNA、P16、、P21、P53)的表达变化；免疫组化法检测各组小鼠脑组织神经标志物(DCX、Nestin、NSE)表达。
　　结果:
　　1、体外实验发现，P3代hUC-MSCs贴壁生长，呈梭型，旋涡状，表面光滑，轮廓清晰；H2O2处理后，细胞贴壁能力减低，细胞贴壁宽度变窄，表面有泡状突起。H2O2对hUC-MSCs具有浓度和时间依赖性的损伤作用，考虑细胞的增殖能力和死亡率，选用200μM H2O2处理16h作为氧化损伤模型的最适条件。rhMG53处理对细胞的增殖能力具有浓度依赖的增强作用，选用30μg/mL rhMG53作为实验使用浓度。与NC组相比，rhMG53组细胞增殖和迁移能力显著提高，S期比例变化差异不大，细胞衰老和凋亡比例显著降低，细胞SOD活力显著增加，MDA含量显著降低；H2O2组细胞增殖、迁移能力和S期细胞比例显著降低，细胞衰老和凋亡比例显著增加，细胞SOD活力显著降低，MDA含量显著增加。与H2O2组相比，Pre组细胞增殖和迁移能力显著提高，S期比例变化差异不显著，细胞衰老和凋亡比例显著降低，细胞SOD活力显著增加，MDA含量显著降低。
　　2、体内实验鉴定获得APP+转基因模型鼠40只。移植一周后，与hUC-MSCs组相比，联合组脑组织迁移的干细胞数目显著增加。移植两周后，与APP+组和hUC-MSCs组相比，MG53组和联合组小鼠的运动能力均有显著提高。移植四周后，与APP+组相比，各处理组小鼠逃避潜伏期时间缩短、穿越平台次数增多、平台所在象限停留时间增加，SOD活性增加，MDA含量下降，脑组织中Sirt1、Sirt2、PCNA基因的mRNA和蛋白表达增加，而P16、P21、P53基因的mRNA和蛋白表达降低，差异显著；hUC-MSCs组和联合组小鼠脑组织DCX和Nestin的表达增多，NSE表达变化差异不显著。与hUC-MSCs组相比，联合组小鼠逃避潜伏期时间显著缩短，血清中SOD活性显著增加而MDA含量显著下降，脑组织中Sirt1、Sirt2、PCNA基因的mRNA和蛋白表达增加，而P16、P21、P53基因的mRNA和蛋白表达降低。
　　结论:
　　1、rhMG53蛋白能够提高hUC-MSCs的存活和迁移，rhMG53预处理能够提高hUC-MSCs的抗氧化能力，减低H2O2对细胞造成的氧化损伤。
　　2、外源rhMG53蛋白可以增加小鼠体内hUC-MSCs的存活和迁移数目，改善APP+鼠的学习和认知能力，促进神经细胞的增殖，对hUC-MSCs移植治疗阿尔茨海默鼠有促进作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩略对照表

引言

第一部分 rhMG53对hUC-MSCs氧化损伤的保护作用

前言

1.1 材料与方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4小结

第二部分 rhMG53蛋白联合hUC-MSCs对阿尔茨海默鼠的治疗作用

前言

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

结论

参考文献

综述: MG53蛋白参与细胞和组织的损伤修复

附录 实验主要设备及耗材

个人简历

硕士期间发表论文及获奖情况

致谢