IL23/Th17通路基因miR-SNPs与胃癌易感性关联分析及初步功能验证

摘要

胃癌（GC）作为常见的消化系统恶性肿瘤，在我国其发病率和病死率居高不下，对个人、社会及国家均已造成严重负担，是迫在眉睫的公共卫生问题。胃癌的发生是多种因素共同作用的结果，其中幽门螺杆菌（H. pylori）感染和遗传因素的相互作用越来越受到瞩目。在我国家族性胃癌仅占胃癌的1％-3%，其中90%以上为散发性胃癌，表现为较弱的遗传易感性，这很可能与基因单核苷酸多态性（SNP）有关。国内外许多相关研究均证实炎性因子通路基因的多态性与胃癌前炎症反应密切相关。microRNA（miRNA）可通过与炎性因子相关基因的3'非翻译区（3'-UTR）靶向结合调控炎性基因表达。炎性基因3'-UTR的miRNA靶序列中的SNP（miR-SNP）可通过增强或减弱miRNA对炎性基因的调控作用，诱导局部免疫反应，最终导致胃癌发生。
　　目的:探讨IL23/Th17炎症轴通路基因miR-SNPs（IL17A rs3748067、IL17RA rs887796、IL17RA rs1468488和IL23R rs10889677）与胃癌遗传易感性的关联，以及四个miR-SNPs与环境交互作用在胃癌发生中所起的作用。然后对筛选出的阳性miR-SNP所预测的miR-10a-3p进行后续功能验证，探索miR-10a-3p对IL23/Th17通路靶基因IL17A的调控机制，为探究胃癌的发生机制提供思路，为胃癌的早期预防及诊断提供理论依据。
　　方法:
　　（1）采用生物信息学方法，在NCBI SNP数据库中搜索IL23/Th17通路相关的miR-SNPs，按照一定标准对SNP进行筛选，然后结合多种miRNA预测数据库对miR-SNPs对应的miRNA进行预测并计算其结合自由能；
　　（2）采用病例对照研究，在郑州大学第一附属医院选取500例胃癌患者，并在同一时间按性别和年龄（±5岁）在社区健康对照人群中进行频数匹配选取对照500例，病例及对照人群均为中国汉族人群。然后采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）方法对四个位点进行基因分型，采用拟合优度检验检测对照人群是否符合Hardy-weinberg定律，采用非条件logistic回归检验纳入的miR-SNPs与胃癌患病风险的关联性，采用SHEsis在线软件进行IL17RA基因的单体型分析，采用MDR2.0软件分析基因-基因及基因-环境的交互影响。以上检验均在SPSS21.0软件中进行；
　　（3）将miR-10a-3p过表达载体、miR-10a-3p抑制物及其各自对照组分别转染到胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823细胞内，采用qRT-PCR检测miR-10a-3p和IL17A的相对表达量，采用Western-blot检测IL17A蛋白的表达水平，采用双荧光素酶报告基因检测相对荧光素酶活性，判断IL17A是否为miR-10a-3p的靶基因。
　　结果:
　　（1）miR-SNPs基因分析结果:IL17A rs3748067位点 CT基因型及CT+TT基因型均能够显著降低胃癌的发病风险（OR调整=0.59;95%CI:0.44-0.79、OR调整=0.58;95%CI:0.43-0.77），IL23R rs10889677位点的CC基因型可显著增加胃癌发病风险(OR调整=2.22;95%CI:1.27-3.87)；
　　（2）分层分析结果：IL17A rs3748067在男性(OR调整=0.55;95%CI:0.40-0.75)、年龄超过50岁(OR调整==0.57;95%CI:0.41-0.78)，有吸烟史(OR调整=0.43;95%CI:0.29-0.63)、饮酒史(OR调整=0.50;95%CI:0.31-0.79)及无胃癌家族史(OR调整=0.58;95%CI:0.43-0.79)的人群中能够更显著的降低胃癌患病风险。IL23R rs10889677在男性(OR调整=1.29;95%CI:1.02-1.65)、有吸烟史(OR调整=1.40;95%CI:1.05-1.85)及无胃癌肿瘤家族史(OR调整=1.33;95%CI:1.06-1.66)的人群中与胃癌患病风险的关联性更强；
　　（3）基因-环境因素的交互作用分析：具有吸烟史、肿瘤家族史并联合rs3748067位点突变基因型的人群患胃癌的风险为其它人群的2.25倍；
　　（4）qRT-PCR结果： GenePharma-miR-21载体和miR-21抑制物转染到SGC-7901和BGC-823细胞后，与对照组相比，miR-21和PTEN相对表达量的差异经t检验均具有统计学意义，GenePharma-miR-10a-3p载体和miR-10a-3p抑制物转染到SGC-7901和BGC-823细胞后，与对照组相比，在SGC-7901细胞中miR-10a-3p和IL17A相对表达量的差异经t检验均具有统计学意义，但在BGC-823细胞中IL17A相对表达量的差异经t检验不具有统计学意义；
　　（5）Western-blot结果：GenePharma-miR-21载体和miR-21抑制物转染到SGC-7901和BGC-823细胞后，与对照组相比，PTEN蛋白的相对表达量的差异经t检验具有统计学意义，GenePharma-miR-10a-3p载体和miR-10a-3p抑制物转染到SGC-7901和BGC-823细胞后，与对照组相比，在SGC-7901细胞中IL17A蛋白相对表达量的差异经t检验均具有统计学意义，但在BGC-823细胞中IL17A蛋白相对表达量的差异经t检验不具有统计学意义；
　　（6）双荧光素酶报告实验结果：IL17A-UTR-WT质粒和miR-10a-3p mimic共转染组与其对照组相比，两者相对荧光素酶活性差异经t检验具有统计学意义，IL17A-UTR-WT质粒和miR-10a-3p inhibitor共转染组与其对照组相比，两者相对荧光素酶活性差异经t检验也有统计学意义。
　　结论:
　　（1）IL17A rs3748067位点的CT基因型及CT+TT基因型均能够显著降低胃癌的发病风险，IL23R rs10889677位点的CC基因型可显著增加胃癌发病风险，具有吸烟史、肿瘤家族史并联合rs3748067位点突变基因型的人群患胃癌的风险较高；
　　（2）GenePharma-miR-10a-3p载体和miR-10a-3p抑制物成功转染到SGC-7901和BGC-823细胞后，在SGC-7901细胞中，miR-10a-3p可在mRNA和蛋白水平调控IL17A的表达，但在BGC-823细胞中，未观察到miR-10a-3p对IL17A表达的调控作用；
　　（3）双荧光素酶报告实验从miR-10a-3p的mimic和inhibitor正反两个方向验证了miR-10a-3p对IL17A-UTR的调控作用，说明IL17A是miR-10a-3p的靶基因。

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英文缩略词表

1 前言

2 材料与方法

2.1 常用实验试剂

2.2 常用实验器材

2.3 所需实验试剂的配制

2.4 研究方法

3 结果

3.1 胃癌病例组和对照组的一般特征

3.2 基因型判定

3.3 四个位点与胃癌遗传易感性关联分析

3.4 四个位点与胃癌遗传易感性关联的分层分析

3.5 IL17RA 基因rs1468488 和rs887796位点的单体型分析

3.6 突变位点数量分析

3.7 基因-环境的交互作用分析

3.8 细胞总RNA提取

3.9 miR-21相对表达量的检测

3.10 PTEN相对表达量的检测

3.11 miR-10a-3p相对表达量的检测

3.12 IL17A相对表达量的检测

3.13 Western-blot检测SGC-7901和BGC-823细胞中PTEN蛋白的表达

3.14 Western-blot检测SGC-7901和BGC-823细胞中IL17A蛋白的表达

3.15 miR-10a-3p靶基因的双荧光素酶验证实验

4 讨论

4.1 IL23/Th17通路与胃癌

4.2 IL23/Th17通路相关基因miR-SNPs与胃癌的关系

4.3 miR-10a-3p靶基因IL17A的验证

4.4 本研究的优缺点

5 结论

参考文献

综述: 新型非编码RNA在肿瘤中作用的研究进展

个人简历及学术论文发表情况

致谢