二甲双胍对IVF/ICSI中PCOS患者妊娠结局和子宫内膜miRNAs的影响

摘要

多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）是女性常见的妇科内分泌疾病之一，同时也是引起育龄妇女不孕的最常见原因。PCOS患者临床表现多样化，主要特征为月经稀发、慢性排卵、胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)、高雄激素血症；另外发生糖尿病、心血管疾病、子宫内膜癌的风险也增加。PCOS是在1935年由Stein和Leventhal首次报道，故又称为Stein-Leventhal综合征。目前，PCOS的病因不明，但是多数研究认为IR是PCOS患者发生的一个重要原因。
　　成功妊娠最关键的两个因素是植入高质量的胚胎及良好的子宫内膜容受性。对于因排卵障碍或同时伴有男方不育因素的PCOS不孕症患者，经诱发排卵或体外受精/卵胞浆内单精子显微注射（invitrofertilization/intracytoplasmicsperminjection，IVF/ICSI）等辅助生殖技术（assistedreproductivetechnology，ART）助孕后可使多数患者妊娠，但与非PCOS患者相比较，PCOS患者助孕后仍存在妊娠率低和流产率高的情况；即使植入高质量的胚胎，仍未获得满意的效果，因此，推测可能与子宫内膜容受性受损有关。有一些研究显示，PCOS患者植入窗期子宫内膜同源框基因(homeoboxgeneA10,HOXA10)、整合素β3（integrinβ3,ITGB3）及阴道超声下子宫内膜及内膜下的血流等评价内膜容受性的参考指标显著降低，提示胚胎植入窗期PCOS患者的子宫内膜容受性可能存在缺陷。本课题组前期通过对PCOS患者子宫内膜局部的内分泌代谢状况进行了研究，结果显示PCOS患者的子宫内膜局部存在IR，而且还暗示了子宫内膜的代谢水平有可能降低，因为当PCOS患者子宫内膜存在IR时，子宫内膜的代谢会异常，进而引起子宫内膜增生性病变或功能的异常。因此，如何治疗因胰岛素抵抗导致的子宫内膜容受性受损以及后续不良的妊娠结局是当今生殖领域亟待解决的一项难题。
　　在子宫内膜容受性的过程中可受到诸多蛋白质、脂类、核酸、microRNA（miRNA）等因素的调控影响。目前研究显示miRNAs在影响胚胎植入过程的相关因子中起着非常重要的作用。
　　二甲双胍作为临床上最常用的胰岛素增敏剂，最初是应用于II型糖尿病的一线治疗，是一种安全高效的双胍类降糖药，具有增加组织细胞对胰岛素的敏感性、改善组织代谢的功能。目前国内外有很多关于二甲双胍治疗与PCOS的基础及临床研究认为二甲双胍可降低PCOS患者血清、组织内的胰岛素水平、提高妊娠率、降低流产率以及改善子宫内膜的代谢功能及容受性，但是机制不清。miRNA的出现不仅让学者们认识到了疾病存在复杂的分子生物学机制，同时也为研究者研究复杂疾病提供了一个新的研究方向和研究思路。基于miRNAs重要的调控作用，因此提出科学假设，二甲双胍是否通过miRNA途径改善PCOS患者子宫内膜的容受性？鉴于此，本课题将采用miRNA芯片技术测定二甲双胍治疗后有关PCOS患者子宫内膜miRNAs表达谱的情况，以期为临床治疗提供理论依据。
　　目的：
　　本研究首先对二甲双胍在IVF/ICSI中PCOS患者的应用进行了前瞻性研究，通过观察二甲双胍对PCOS患者临床妊娠结局的影响；然后通过Westernblot技术对未移植的PCOS患者子宫内膜组织进行内膜容受性分子标志物的检测以及miRNA芯片技术检测子宫内膜miRNA差异的表达，旨在为PCOS患者助孕前的干预治疗提供理论依据。
　　方法：
　　1.将拟行IVF/ICSI助孕的120例PCOS患者随机分为二甲双胍组(A组)及对照组（B组）；A、B组中因卵巢过度刺激综合征未移植的患者分别为A1组和B1组。A组所有的患者均于月经或撤退性出血的2-5天开始，于餐前半小时开始口服二甲双胍，500mg/次，3次/日至取卵后的第6天。然后比较A、B两组PCOS患者的辅助生殖相关参数，以评估二甲双胍对IVF/ICSI中PCOS患者妊娠结局的影响。
　　2.对A、B两组中未移植的PCOS患者于取卵后的第6天进行子宫内膜采集，然后将收集到的子宫内膜分别进行Westernblot检测，比较子宫内膜容受性分子标志物HOXA10、ITGB3蛋白的表达水平以及miRNA芯片技术检测，比较两组子宫内膜组织差异性表达的miRNAs以及对miRNA芯片的结果进行验证，最后利用生物信息学系统对差异性显著表达的miRNAs进行靶基因的预测、Go和Pathway的分析。
　　结果：
　　1.与二甲双胍治疗前相比较，A组患者在二甲双胍干预治疗后胰岛素抵抗指数明显下降（2.76?1.52vs.3.79?1.56，P<0.05）。
　　2.A组的PCOS患者IVF/ICSI的临床妊娠率高于B组（58.9％vs.37.5%,P<0.05），流产率和OHSS发生率均低于A组（6.7%vs.27.8%,8.3%vs.21.7%，P<0.05）。
　　3.A1组中PCOS患者子宫内膜容受性分子标志物HOXA10、ITGB3蛋白水平表达均显著高于B1组（0.95?0.03vs.0.58?0.08，0.97?0.02vs.0.42?0.19,P<0.05）。
　　4.miRNA芯片结果显示：两组患者子宫内膜组织差异性显著的miRNA共有40个，其中明显上调的miRNAs有19个，明显下调的miRNAs有21个（根据2倍差异和P<0.05的参考标准），且验证结果证明芯片结果可靠。
　　5.通过Go和Pathway分析对差异性显著表达miR-194、miR-491、miR-1910的下游靶基因富集分析，发现miRNAs主要参与胰岛素、能量代谢、胚胎着床、黏附作用等方面的信号通路。
　　结论：
　　1.在IVF/ICSI中，二甲双胍可提高PCOS患者临床妊娠率，降低流产率。
　　2.二甲双胍可增加PCOS患者子宫内膜HOXA10、ITGB3蛋白水平的表达，从而改善子宫内膜的容受性。
　　3.二甲双胍可能通过调控miR-194、miR-491、miR-1910等miRNAs改善PCOS患者的子宫内膜容受性。

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缩略词表

前言

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.2 入选和排除标准

1.3 实验分组和给药

1.4 主要试剂

1.5 主要仪器

1.6 研究方法

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 A、B两组患者一般资料及基础内分泌水平的比较

2.2 二甲双胍治疗后A组PCOS患者内分泌参数的比较

2. 3 A、B两组患者辅助生殖相关参数的比较

2.4 A1、B1两组患者子宫内膜HOXA10、ITGB3蛋白水平的表达

2.5 A1、B1两组患者子宫内膜miRNAs 的实验研究结果

3 讨论

3.1 二甲双胍对PCOS患者内分泌代谢的影响

3.2 二甲双胍对IVF/ICSI中PCOS患者妊娠结局的影响

3.3 二甲双胍对PCOS患者子宫内膜容受性的影响

3.4 二甲双胍对PCOS患者子宫内膜miRNAs的影响

4 结论

参考文献

综述: 二甲双胍治疗多囊卵巢综合征患者的研究新进展

个人简历及攻读硕士期间发表论文

致谢