正常人肝10种细胞色素P450及微粒体蛋白含量、活性研究

摘要

细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是肝脏的主要药物代谢酶，参与临床70％～80%常用药物的代谢，主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5等10种亚型。CYP代谢药物活性的不同是临床药物反应个体差异的主要原因，主要表现在酶基因多态性和含量差异性两个方面。
　　CYP基因多态性的研究成果已得到广泛认可，但尚不足以完全解释药物的个体差异。CYP含量差异性是药物个体差异的另一重要影响因素，但正常人肝CYP含量的大样本研究至今尚无报道。究其原因，正常人肝标本来源受限和缺乏准确可靠的定量方法是困扰CYP研究的重要因素。目前，基于质谱的蛋白质组学定量技术发展迅速，稳定同位素稀释内标-多反应监测-质谱技术（Multiple Reaction Monitoring coupled with Stable Isotope Dilution Mass Spectrometry，SID-MRM-MS）已成为目前蛋白质定量的较为理想的方法。由于缺乏正常人肝CYP含量标准，酶含量差异性、转录调控、遗传及其表观遗传学的调控机制尚无法开展系统研究。因此研究正常人肝CYP含量，并探讨其转录调控及表观遗传学调控机制，对进一步探讨药物代谢酶对药物代谢个体差异的影响，指导临床个体化合理用药，具有重要的理论和实际意义。
　　每克肝组织中的微粒体含量（Microsomal Protein Per Gram of Liver，MPPGL）是影响 CYP代谢个体差异的另一重要因素，也是生理药代动力学模型（Physiologically-Based Pharmacokinetics，PBPK)中将药物体外代谢清除率推至体内清除率过程中的一个重要校正因子。为了正确地预测药物体内的代谢清除率，需准确测定MPPGL的含量及含量的个体差异，至今尚无大样本正常人肝微粒体蛋白生理含量的研究报道。
　　体内体外外推（In Vitro-In Vivo Extrapolation，IVIVE)给研究者提供了在研究体内药代动力学之前获得药物代谢定量数据的机会。通常，IVIVE时，用的是各参数的平均值，只能得到单点的体内清除率，常常导致预测的偏差。如果用参数的个体数据进行预测，即可得到体内清除率的范围，降低预测的偏差，为临床提供更加可靠的数据。
　　本课题拟以已收集的正常人肝标本为研究对象，采用qPCR的方法，对107例正常人肝10种CYP的mRNA进行定量；采用SID-MRM-MS对100例正常人肝10种CYPs亚型含量进行定量，明确正常生理范围，发现个体差异程度；对107例正常人肝中调控CYPs各种亚型的转录因子及miRNA进行定量，从转录水平及表观遗传学角度阐述影响酶含量的机制；选用特异性探针，研究10种CYP亚型水平的酶动力学，明晰药物代谢的个体差异程度。对10种CYP亚型进行基因分型，明确基因多态性对CYP含量及活性的影响，发现基因型对个体差异的影响程度。
　　另外，测定128例正常人肝MPPGL的含量，明确正常生理范围，发现个体差异程度；测定10种CYP在微粒体水平与肝脏水平的代谢活性，比较两种活性之间的差异。另外，用78例样本MPPGL、CLint等5种参数个体数据预测CYP2C9探针药物甲苯磺丁脲体内肝清除率的个体差异，以期为基于 PBPK的体内清除率预测提供生理参数。
　　1、方法：
　　1.1人肝标本收集128例肝功能正常的人肝组织样本。其中男性40例，女性88例，平均年龄47.2岁。吸烟或饮酒者各13例。
　　1.2人肝微粒体的制备及微粒体蛋白含量的测定差速离心法制备人肝微粒体(Human Liver Microsome，HLM)，采用Bradford法测定微粒体蛋白浓度。
　　1.3 CYP基因多态性的测定选择在中国汉族人群中基因多态性发生频率在1%以上的位点，对10种 CYP亚型进行基因分型，共25个多态性位点，用SNP MassARRAY分型检测。
　　1.4荧光定量PCR测定mRNA及miRNA的表达将1μg的总RNA逆转录成cDNA，两步法在7500 Fast Real-Time PCR System进行PCR扩增。miRNA定量先将1μg的总RNA进行反转录，反转录产物5倍稀释后三步法在进行PCR扩增。
　　1.5 SID-MRM-MS测定人肝微粒体CYP亚型蛋白的含量将10种CYP亚型的特异性肽段序列整合在一个QconCAT蛋白序列中，用大肠杆菌表达同位素标记该蛋白序列，纯化后，和待测样品一起酶切，脱盐后Triple TOF5600+质谱仪进行SID-MRM-MS分析定量。
　　1.610种CYP亚型酶活性的测定100μl的人肝微粒体孵育体系中分别加入不同浓度的系列CYP的特异性底物、EDTA、磷酸盐缓冲液、氯化镁等，37℃预孵育后加入 NADPH启动反应，后加冰乙腈、乙酸乙酯或高氯酸终止反应，用HPLC-UV或HPLC-FLD进行分析测定。
　　1.7 MPPGL含量测定通过同时测定同一样品肝匀浆及HLM中的NADPH-细胞色素P450还原酶（POR）的活性计算MPPGL。MPPGL（mg/g）=每克肝脏POR活性/每毫克HLM的POR活性=nmol Cyt.c min-1 g-1/nmol Cyt.c min-1mg-1
　　1.8甲苯磺丁脲肝清除率的预测先将甲苯磺丁脲的体外清除率（CLint,in vitro）转化成整肝清除率（CLint,liver），再用充分搅拌模型进行预测，用每一例样本的5种参数（MPPGL，CLint，in vitro，LW，QH及BW）数据进行预测，得到体内肝清除率的范围。预测准确度用AFE(Average Fold-error，平均误差倍数)判定。
　　1.9统计方法 SPSS21.0统计软件进行统计学分析，Prism5.0软件作图。因本实验大部分数据为非正态分布，用非参数检验进行统计分析，P<0.05为有统计学意义。
　　2、结果：
　　2.1人肝中10种CYP的表达
　　2.1.1人肝微粒体中CYP亚型蛋白含量100例正常人肝中10种CYP亚型含量均呈非正态分布。含量为4.62（CYP2B6）到102.04pmol/mg（CYP2E1）（中位数），CYP3A4含量个体差最大，129倍，其它CYP含量差异倍数为11~100倍。除了7对CYP之外，其它的CYP亚型蛋白含量之间均有显著性相关性(P<0.05)。
　　2.1.210种CYP mRNA的表达100例正常人肝中10种CYP的mRNA均呈非正态分布。相对表达水平0.19（CYP2D6）到5.94（CYP2E1）（中位数）。CYP2A6表达水平个体差异倍数最大，168倍，其它 CYP mRNA表达水平差异倍数为8~122倍。除了4对CYP之外，其它的CYP mRNA表达水平之间均有显著性相关性(P<0.05)。
　　2.1.3 CYP mRNA与相应蛋白之间的相关性只有CYP1A2、CYP2A6的mRNA与蛋白含量具有显著相关性（P<0.01)。
　　2.2 CYP表达水平的影响因素
　　2.2.1转录因子4种转录因子PXR、HNF4α、CAR及AHR的mRNA水平均呈非正态分布，表达水平均较低，但个体差异较大，从12到85倍。除PXR与AHR之外，其它的转录因子mRNA的表达水平之间均有显著相关性(P<0.05)。
　　除了AHR与CYP2C9、CYP2D6之外，其它的转录因子与CYP在mRNA表达水平之间均有显著性相关性(P<0.05)。转录因子的mRNA表达水平与CYP的蛋白含量之间的相关性较差。
　　2.2.2 miRNA7种miRNA表达水平均呈非正态分布。其中miRNA-27b在肝组织中的表达丰度最高，miRNA-34a丰度较低。miRNA-27b个体差异达618倍，其它 miRNA的差异倍数为89~312倍。7种 miRNA之间均有显著性相关性(P<0.019)。
　　miRNA与CYP的mRNA表达水平呈显著负相关(P<0.05)；miRNA与与部分CYP的蛋白含量有显著相关性；miRNA与CYP的蛋白翻译效率无著性相关(P>0.05)。
　　2.2.3基因多态性
　　CYP基因多态性对 mRNA的影响 CYP1A2-3113A>G、CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2D6100C>T(*10)、CYP2D61661G>C、CYP3A5 A>G(*3)突变对mRNA表达水平有显著影响（P<0.05）。
　　CYP基因多态性对蛋白含量的影响 CYP1A25347C>T、CYP1A22159G>A、CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2C9*3、CYP2D6*10、CYP2D61661G>C、CYP2E1-1293G>C、CYP2E17632T>A、CYP2E1-333T>A与CYP3A5 A>G突变对蛋白含量有显著影响。
　　2.2.4人口学因素男性组 CYP1A2的mRNA表达水平显著高于女性组（P=0.014）；随着年龄的增加CYP2B6、CYP3A4、CYP2C8、CYP2C9及CYP2C19的mRNA表达水平下降(P<0.05)；随着年龄的增加，CYP3A5蛋白含量明显增加(P<0.05)。
　　2.310种CYP亚型水平活性90例样本中10种CYP亚型的Vmax、Km和CLint活性均呈非正态分布。10种CYP Km为1.9~230.4μm/L（中位数），Vmax为1.2~21 pmol/min/pmolCYP（中位数），CLint为0.012~10.8μl/min/pmolCYP（中位数）。10种CYP亚型酶动力学参数存在大的个体差异，Vmax的个体差异9~1697倍；CLint为23~625倍；Km个体差异相对较小，为3~40倍。
　　除 CYP2C19之外，其它的CYP亚型水平 Vmax之间均有显著性相关性(P<0.05)。除了CYP2C19与5种CYP，CYP3A5与4种CYP均无相关性之外，其它的CYP亚型水平CLint之间均有显著性相关性(P<0.05)。10种CYP亚型Km之间的相关性较差，仅7对CYP之间有相关性(P<0.05)。
　　2.4基因多态性对10种 CYP亚型水平活性的影响 CYP1A25347C>T、CYP1A22159G>A、CYP2A*4、CYP2A6*9、CYP2D6*10、CYP2D61661G>C及CYP3A5*3对酶动力学参数有显著影响（P<0.05）。
　　2.5 MPPGL含量128中国正常人肝样本的MPPGL呈非正态分布。MPPGL的平均含量为39.46 mg/g liver，范围6.71到127.95mg/g liver，个体差异19倍。性别、年龄、吸烟、饮酒及临床诊断对MPPGL含量均无显著影响(P>0.05)。
　　2.6 CYP微粒体水平与肝组织水平活性10种CYP微粒体水平的活性（转化速率）31.50~677.94pmol/min/mg protein（中位数），个体差异6~232倍。用每个个体微粒体水平的活性乘以其相对应的MPPGL的含量，代表每克肝组织水平CYP的活性（转化速率）。肝组织水平CYP活性0.96-29.05 nmol/min/g liver，个体差异23~210倍。
　　除了CYP2C19之外，肝脏水平CYP活性的个体差异均高于微粒体水平。9种CYP肝脏水平活性个体差异的倍数变化比相对应的微粒体水平活性的个体差异倍数分别高18%~278%。与微粒体水平活性相比，肝脏水平的活性在10种CYP中的每一种都有较大的位次改变。CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9和CYP2E1，分别有47%、41%、40%和41%的样本位次变化幅度超过20%。
　　2.7甲苯磺丁脲体内肝清除率的预测7种方法预测的甲苯磺丁脲的肝清除率的平均值均为0.113 ml/min/kg，但预测范围区间则有明显的差异。方法G为目前通用的预测方法，用各种参数的平均值预测，仅仅得到肝清除率的预测平均值；本实验所用的方法A，78例样本每个个体的5种参数，预测出甲苯磺丁脲的肝清除率的变异区间0.012~0.558 ml/min/kg，个体差异51倍。
　　3、结论：
　　1.提供了正常人肝10种CYP亚型蛋白及微粒体蛋白含量的正常值，两者均有明显个体差异。
　　2.提出新的CYP活性表示方法。亚型水平活性代表 CYP的真正活性，肝组织水平的CYP活性更接近体内情况。
　　3.提出了预测体内肝清除率个体差异的新方法，采用体外人肝微粒体蛋白含量等个体数据，成功预测了CYP2C9探针药物甲苯磺丁脲体内肝清除率的个体差异。
　　4. CYP基因多态性对CYP亚型蛋白及活性个体差异的影响较大，而miRNA及人口学因素影响较小。

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引言

参考文献

第一部分 正常人肝10种细胞色素P450含量、活性及其个体差异

1 前言

2 材料与方法

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 小结

参考文献

第二部分 人肝微粒体蛋白含量、活性及体内个体肝清除率的预测

1 前言

2 材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 小结

参考文献

全文小结

综述:细胞色素P450基因表达调控研究进展