miR-140在先天性心脏病肺动脉高压的作用机制

摘要

先天性心脏病是最常见的先天性疾病，在世界范围内影响1％的新生婴儿。肺动脉高压是先天性心脏病常见的并发症，是引起围手术期病人死亡的重要原因，其主要特征是肺血管阻力持续性升高。先天性心脏病肺动脉高压的发病机制主要有肺血管重构和动力型肺血管阻力增加等。目前针对先天性心脏病肺动脉高压缺乏有效的治疗手段，进一步研究先天性心脏病的发病和调控机制，寻找更有效更安全的治疗方法，具有积极的意义。
　　miRNA与心脏发育、心脏疾病的发生等过程密切相关。miRNA广泛参与到肺动脉高压发生发展的过程，调节细胞的代谢、增殖和凋亡等多种生理过程，并对多种信号通路具有调节作用。本研究首先检测了先天性心脏病肺动脉高压患者肺组织miR-140及Wnt信号通路相关蛋白表达及其与肺组织血管结构、肺血管细胞凋亡的关系，又进一步研究了miR-140对HPASMC增殖、迁移和表型的影响，再进一步验证miR-140与Wnt信号通路的关系，最后探索了Wnt信号通路对HPASMC增殖、迁移和表型的影响，为进一步研究先天性心脏病肺动脉高压的发病和调控机制奠定了基础。本研究共分为以下两个部分。
　　第一部分 miR-140与先天性心脏病肺动脉高压
　　方法：
　　1.利用qRT-PCR和western blot检测先天性心脏病肺动脉高压患者肺组织miR-140及Wnt信号通路相关蛋白Wnt-1和β-catenin mRNA及蛋白水平的表达变化，并分析了miR-140与肺动脉压高低的关系。对照组为无肺动脉高压的先天性心脏病患者。
　　2.利用HE染色的方法研究了先天性心脏病肺动脉高压患者肺组织形态变化、血管结构WT%、WA%变化，并分析了miR-140与WT%、WA%的关系。
　　3.利用TUNEL的方法检测了先天性心脏病肺动脉高压患者肺组织的凋亡情况并计算了凋亡指数（apoptosis index，AI），采用qRT-PCR和western blot的方法检测了肺组织中凋亡相关蛋白bax，bcl-2，survivin的表达变化，并分析了miR-140表达的变化与AI，bax，bcl-2和survivin的关系
　　结果：
　　1.和无肺动脉高压患者相比，并发肺动脉高压患者miR-140表达下调，Wnt信号通路相关蛋白Wnt-1和β-catenin表达上调，相关性分析显示miR-140表达量与肺动脉压、Wnt信号通路相关蛋白Wnt-1和β-catenin表达均呈负相关。
　　2.无肺动脉高压患者肺组织病变不明显，轻度肺动脉高压患者肺间隔轻微增厚，叶间隔增宽，肺泡腔及小血管轻度充血。中重度肺动脉高压患者肺泡明显扩张，肺泡间隔增宽明显，局部纤维化，血管管壁增厚，管腔狭窄。随着肺动脉压力的增高，患者肺组织血管管壁逐渐增厚，WT%、WA%逐渐上升。相关性分析显示WT%、WA%与肺动脉压力呈正相关，与miR-140负相关。
　　3.肺动脉高压患者肺组织血管内凋亡细胞数量减少，AI下降，相关性分析显示AI与miR-140呈正相关，与肺动脉压力、WT%、WA%呈负相关。qRT-PCR及western blot结果显示bax在无肺动脉高压及轻度肺动脉高压患者肺组织中表达较多，中重度肺动脉高压患者bax表达明显减少，bcl-2、survivin表达则与bax相反。相关性分析显示miR-140与bax呈正相关，与bcl-2，survivin表达呈负相关。
　　第二部分 miR-140在肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）作用机制方法
　　1.将原代培养的HPASMCs置于低氧与常氧的培养箱中分别培养24 h和48 h，然后采用qRT-PCR和western blot的方法分别检测miR-140、Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白的表达情况的表达情况。
　　2.转染miR-140 mimic和inhibitor，在缺氧条件下培养HPASMCs，利用CCK-8法检测miR-140对HPASMCs增殖的作用，细胞划痕实验检测HPASMCs迁移能力的变化，western blot检测与平滑肌细胞收缩表型相关的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表达水平的变化。
　　3.将转染miR-140 mimic和inhibitor的HPASMCs置于缺氧培养箱中培养24 h，采用qRT-PCR和western blot方法分别检测Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白的表达情况。
　　4.通过TargetScan，DIANA和miRanda在线工具预测Wnt-1的miR-140识别位点，利用双荧光素酶报告分析miR-140和Wnt-13’-UTR的相互作用。
　　5.通过转染重组质粒或siRNA过表达或敲降Wnt-1，采用CCK-8法检测过表达及敲降Wnt-1对HPASMCs的增殖能力的影响，细胞划痕实验检测Wnt-1对HPASMCs迁移的影响，western blot检测与平滑肌细胞收缩表型相关的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表达水平的变化。
　　结果：
　　1. qRT-PCR和western blot结果显示，在缺氧条件下HPASMCs中miR-140表达下调，Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白表达上调。
　　2.缺氧条件下，转染miR-140 mimic过表达miR-140，HPASMCs的增殖速率明显降低，迁移距离和迁移细胞数减少，平滑肌细胞收缩表型相关的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表达显著增强；转染miR-140 inhibitor抑制miR-140表达，细胞增殖速率升高、迁移增加，收缩表型相关蛋白表达减少。
　　3.缺氧条件下，转染miR-140 mimic过表达miR-140，Wnt-1的mRNA和蛋白的表达水平显著降低，转染miR-140 inhibitor抑制miR-140表达，Wnt-1的mRNA和蛋白表达水平显著升高。
　　4.通过TargetScan，DIANA和miRanda在线工具预测发现，Wnt-1的3’-UTR有miR-140的识别位点，双荧光素酶报告实验结果表明miR-140和预测的Wnt-13’-UTR识别位点有相互作用。这些结果充分证实了miR-140直接靶向Wnt-1。
　　5.转染重组质粒过表达Wnt-1，在缺氧条件下HPASMCs增殖速率升高，迁移距离和迁移细胞数增多，SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表达降低。转染siRNA敲降Wnt-1表达，细胞增殖速率降低、迁移减少，收缩表型相关蛋白表达增加。
　　结论：
　　1.先天性心脏病肺动脉高压患者miR-140表达下调，Wnt信号通路相关蛋白Wnt-1和β-catenin表达上调，miR-140表达量与肺动脉压、WT%、WA%呈负相关，与AI呈正相关。
　　2.在缺氧条件下HPASMCs中miR-140表达下调，Wnt-1表达上调，miR-140直接靶向Wnt-13’-UTR从而抑制Wnt-1的表达。
　　3.在缺氧诱导的HPASMCs中miR-140可以抑制HPASMCs增殖和迁移，促进平滑肌细胞收缩表型蛋白的表达。
　　4. Wnt-1在缺氧诱导的HPASMCs中具有促进增殖迁移的作用，并且可以抑制平滑肌细胞收缩表型蛋白的表达。

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引言

参考文献

第一部分 miR-140与先天性心脏病肺动脉高压

前言

1 材料和方法

2 结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 miR-140在肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）作用机制

前言

1 材料与方法

2 结果

讨论

参考文献

全文结论

综述: miRNA与肺动脉高压

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