CYP3A4*1G对HepG2细胞CYP3A4基因表达的调控作用及机制

摘要

背景与目的：
　　大多数药物经 CYP450酶代谢。CYP酶基因的变异可导致药物不良反应，这成为影响药物安全及患者依从性的主要原因之一。CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员之一，占P450酶系总量的30％～40％，主要分布在肝脏和肠道。CYP3A4*1G（G>A，rs2242480）是CYP3A4内含子10中的一个单核苷酸多态性（SNP），其等位基因频率在不同民族人群中存在明显差异。这个等位基因在高加索人群中少见，但在亚洲人群基因频率超过20%。体内研究表明CYP3A4*1G基因多态性与他克莫司、阿托伐他汀、芬太尼等药物的剂量、疗效及药动学改变有关。本课题组前期用双荧光素酶报告基因技术发现在 HepG2细胞中，CYP3A4内含子10具有受CYP3A4*1G等位基因调控的增强子与启动子活性，并发现 CYP3A4*1G位点附近存在抑制性作用元件。但 CYP3A4*1G及其调控的CYP3A4内含子10与CYP3A4基因表达之间的关系尚不清楚。本研究的目的是探究CYP3A4内含子10及CYP3A4*1G对HepG2细胞CYP3A4表达的影响。基因表达可由转录因子复合物调控。具有启动子和增强子活性的CYP3A4内含子10与某些转录因子结合，进而调控CYP3A4基因的表达。因此本研究的另一目的是探讨与 CYP3A4*1G及其侧翼序列相结合的转录因子，为从内含子 SNP调控基因表达角度解释CYP3A4酶活性的个体差异提供分子机制，进而为临床个体化用药和与用药相关的法医学鉴定提供理论基础。
　　方法：
　　构建一系列真核表达载体，转染入HepG2细胞，培养48h后，qPCR检测CYP3A4 mRNA水平，分别对其进行启动子功能分析（阴性对照组、阳性对照Ⅰ组、野生启动子组、突变启动子组），上游增强子功能分析（阳性对照Ⅰ组、野生增强子组、突变增强子组、反向野生增强子组、反向突变增强子组），下游增强子功能分析（阳性对照Ⅱ组、下游野生增强子组、下游突变增强子组、下游反向野生增强子组、下游反向突变增强子组）。应用SPSS21.0对数据进行处理，采用单因素方差分析和LSD-t检验比较CYP3A4 mRNA表达的差异，检验水准α=0.05。
　　提取 HepG2细胞核蛋白，加入生物素标记 CYP3A4*1G野生型及突变型探针，链霉亲和素pull-down，聚丙烯酰胺凝胶电泳后硝酸银染色，HPLC-MS/MS质谱分析CYP3A4*1G结合的蛋白。
　　结果：
　　(1) CYP3A4内含子10启动子功能分析结果：阳性对照Ⅰ组、野生启动子组、突变启动子组均能够有效地启动CYP3A4基因表达。野生启动子组与阳性对照Ⅰ组 CYP3A4 mRNA表达水平没有显著差异（P>0.05），突变启动子组 CYP3A4 mRNA表达水平显著低于阳性对照Ⅰ组（P<0.05）和野生启动子组（P<0.01）；
　　(2) CYP3A4内含子10上游增强子功能分析结果：无论CYP3A4*1G野生型还是突变型，反向组CYP3A4 mRNA表达水平均高于正向组（P<0.01）；而CYP3A4内含子10无论是正向还是反向，CYP3A4*1G野生型组CYP3A4 mRNA表达水平均高于突变型组（P<0.01）；此外，突变增强子组CYP3A4 mRNA表达水平低于阳性对照Ⅰ组，不但没有增强CYP3A4启动子的功能反而有所减弱。
　　(3) CYP3A4内含子10下游增强子功能分析结果：CYP3A4内含子10无论正向、反向、野生、突变均增强了 CYP3A4启动子的活性，但该增强作用弱且不受CYP3A4*1G调控，尽管正向的增强水平高于反向，但对方向的依赖性并不十分显著。
　　(4) CYP3A4*1G及其侧翼序列结合转录因子分析结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳银染结果显示突变型标记探针组结合蛋白条带数明显多于野生型标记探针组，且颜色深浅有区别；分别加对应的冷探针后，两者的特异性蛋白条带明显减少，且条带的颜色深浅差别更明显；链霉亲和素 pull-down蛋白溶液 HPLC-MS/MS结果显示突变型标记探针结合蛋白数目（738个）多于野生型标记探针结合蛋白数目（697个）。
　　结论：
　　(1) CYP3A4*1G野生型内含子10与CYP3A4启动子活性相近，CYP3A4内含子10的启动子活性受CYP3A4*1G调控，且野生型高于突变型。
　　(2) CYP3A4内含子10还具有类似于增强子的功能，但与普通意义上的增强子又有所不同，具有方向和位置依赖性。
　　(3) CYP3A4内含子10通过CYP3A4*1G等位基因差异性地结合转录因子从而调控了CYP3A4基因的表达。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略词中英文对照表

引言

1 第一部分：CYP3A4*1G对HepG2细胞CYP3A4基因表达的调控作用研究

1.1 前言

1.2 材料与仪器

1.2.1 材料与试剂

1.2.2 仪器与设备

1.3 实验内容

1.3.1 构建载体

1.3.2 检测mRNA表达水平

1.4 结果

1.4.1 构建载体酶切验证

1.4.2 构建载体测序验证

1.4.3 转染HepG2细胞后CYP3A4 mRNA表达结果分析

1.5 讨论

2 第二部分：CYP3A4*1G对CYP3A4基因表达的调控机制研究

2.1 前言

2.2 材料与仪器

2.2.1 材料与试剂

2.2.2 仪器与设备

2.3 实验内容

2.3.1 探针设计

2.3.2 提核蛋白

2.3.3 Pull-down

2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.3.5 硝酸银染色

2.3.6 HPLC-MS/MS

2.4 结果

2.4.1 pull-down蛋白电泳银染结果

2.4.2 Gel DocTM XR+ Silver Stain 程序自动分析银染结果

2.4.3 链霉亲和素pull-down蛋白溶液HPLC-MS/MS结果

2.5 讨论

结论

后续实验方案

参考文献

综述:遗传药理学在法医学中的应用

个人简历

致谢