子宫肌瘤差异表达MicroRNA的筛选及miR-15b-5p调控子宫肌瘤生物学行为的机制研究

摘要

子宫平滑肌瘤（uterine leiomyomas）是育龄期女性生殖系统最常见的良性肿瘤，育龄期妇女平均发病率约为77％，而45岁女性的发病率则高达60%，且发病率呈逐年上升的趋势。子宫肌瘤典型的临床表现包括：经量过多、经期紊乱及以头晕、血色素降低为表现的继发性贫血症状；因瘤体肿大造成的盆腔压迫症状，如尿频、尿急、腹痛等；严重的子宫肌瘤会导致女性不孕和习惯性流产等生育力低下的症状，是妇科住院及全子宫切除的首要原因，浪费大量卫生资源，严重威胁妇女的身心健康。而子宫肌瘤的发病机制至今不清，是国内外研究的热点之一。微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNAs）是一种广泛存在于真核生物细胞中，大小约为21-23个碱基的非编码单链小分子核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），在生物体内发挥重要作用，如细胞增殖，凋亡，应激反应，甚至肿瘤发病等。降解靶基因的信使核糖核酸（message RNA，mRNA）或者抑制靶基因的翻译最终沉默靶基因表达，是细胞内普遍存在的一种精细调节蛋白表达的转录后调控机制。MiRNA参与多种肿瘤的发病过程，如细胞增殖、凋亡、炎症反应、血管生成、组织更新和抑癌致癌基因修饰，与肿瘤预后密切相关，是肿瘤的早期诊断及其预后判断的良好的生物标记物。MiRNA参与子宫肌瘤发病的作用机制的研究尚处于初始阶段。多篇报道显示，子宫肌瘤和子宫肌层中存在差异表达显著的miRNA。检测子宫肌瘤和子宫肌层 miRNA的差异表达，进而深入探讨差异miRNA对肌瘤细胞的生物学功能和调控，为揭示miRNA参与子宫肌瘤的发病机制奠定良好基础。目前，miRNA的研究方法主要有荧光实时定量PCR（Real time-PCR）、miRNA芯片及二代测序技术。而miRNA芯片是筛选子宫肌瘤和子宫肌层差异表达的miRNA的主要方法和经典手段。本研究分为三个部分：
　　第一部分：子宫肌瘤组织差异表达microRNA的筛选研究。
　　目的：通过miRNA芯片筛选子宫肌瘤和配对的子宫肌层样本中差异表达的miRNA，芯片联合生物信息学分析，预测差异表达显著的miRNA的靶基因及其生物学功能。
　　方法：收集2012年11月至2013年1月在郑州大学第三附属医院妇产科因子宫肌瘤行子宫全切术的10例育龄期子宫肌瘤患者的肌瘤组织和配对的肌层组织为研究对象。采用Agilent Human miRNA(8*60K) V19.0芯片筛选3例子宫肌瘤和配对的肌层组织中差异表达显著的miRNA，芯片结果用Agilent配套软件Genespring进行数据预处理和差异分析，采用聚类软件MEV进行聚类分析。应用Real time-PCR在10例子宫肌瘤和配对的肌层组织中验证hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-34a-5p的差异表达。利用MiRDB、TarBase、TargetScan、RNA22、TargetMiner数据库预测上述4个miRNA的靶基因，采用基因本体论（Gene Ontology，GO）和KEGG信号通路分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG Pathway）探寻靶基因可能参与的生物学过程和相关信号通路。
　　结果：⑴发现人子宫肌瘤和子宫肌层组织中45个差异表达的miRNA，其中19个miRNA在子宫肌瘤中表达升高，26个miRNA在子宫肌瘤中表达下降。⑵验证miR-15b-5p、miR-34a-5p、miR-34a-3p、miR-21-5p在子宫肌瘤组织表达显著升高，与芯片结果基本一致，P均<0.0001。⑶子宫肌瘤和肌层差异表达的miRNA的靶基因主要参与形态发育、细胞生长发育等30个生物学过程。⑷子宫肌瘤和肌层差异表达的miRNA的靶基因主要参与癌症、丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）、内噬作用等25个信号通路。
　　结论：子宫肌瘤和正常子宫肌层组织中存在差异表达显著的miRNA。
　　第二部分：miR-15b-5p过表达和低表达对子宫肌瘤细胞生物学特征的影响。
　　目的：根据研究结果，选择子宫肌瘤组织中表达显著升高的miR-15b-5p，通过基因转染技术，使miR-15b-5p在各型肌瘤细胞和肌层细胞中过表达和低表达，并观察 miR-15b-5p低表达对子宫肌瘤细胞增殖的影响，为后续全面研究miR-15b-5p的生物学功能及远期探寻其下游靶基因提供铺垫。
　　方法：采集于2013年8月-2014年2月在美国麻省总院（Massachusetts General Hospital MGH）妇产科生殖内分泌中心因子宫肌瘤行子宫全切术的育龄期患者的肌瘤和配对的肌层组织共20例，部分消化和原代细胞分离培养为子宫肌瘤细胞（pLYO cells）和子宫肌层细胞（pMYO cells）。同时体外培养子宫肌瘤细胞系（cpLYO cells）和子宫肌层细胞系（cpMYO cells）。Real time-PCR检测不同细胞miR-15b-5p的本底表达水平。脂质体在各型细胞瞬时转染miR-15b-5p的模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）及其阳性、阴性对照，应用Real time-PCR验证miR-15b-5p在各组表达情况，建立miR-15b-5p高表达或低表达的模式。采用噻唑蓝实验（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT）检测 miR-15b-5p对原代子宫肌瘤细胞增殖能力的影响。
　　结果：⑴miR-15b-5p在各型细胞中本底表达情况：原代子宫肌瘤细胞中miR-15b-5p的表达水平显著高于原代子宫肌层细胞；子宫肌瘤细胞系中miR-15b-5p的表达水平显著高于子宫肌层细胞系(配对t检验，P<0.001)。⑵miR-15b-5p mimic转染各型细胞24和48h，各型细胞中miR-15b-5p的表达显著升高(配对t检验，P<0.001)。⑶miR-15b-5p inhibitor转染各型细胞24和48h，各型细胞中 miR-15b-5p表达显著降低(配对t检验，P<0.001)。⑷原代子宫肌瘤细胞和子宫肌瘤细胞系中，不同浓度转染 miR-15b-5p inhibitor组与转染其阴性对照组相比，细胞增殖率显著降低。
　　结论：miR-15b-5p可促进子宫肌瘤细胞的增殖能力。
　　第三部分：miR-15b-5p调控子宫肌瘤细胞生物学特征的下游靶蛋白研究。
　　目的：预测并验证 miR-15b-5p在子宫肌瘤细胞的下游靶基因/靶蛋白，检测 miR-15b-5p的下游靶蛋白在子宫肌瘤组织和子宫肌层中的表达差异，进一步揭示miR-15b-5p参与子宫肌瘤发病的分子机制。
　　方法：利用生物信息学数据库MiRDB、TarBase、TargetScan、RNA22、TargetMiner联合预测miR-15b-5p的靶基因。转染miR-15b-5p的mimic，Real time-PCR验证预测的miR-15b-5p的靶基因RECK（Reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs）在各型细胞的mRNA的表达水平；转染miR-15b-5p的mimic和inhibitor及各自阴性对照，免疫印迹实验（Western Blot）验证RECK蛋白在各型细胞的表达水平；转染 miR15b-5p inhibitor及其阴性对照，细胞免疫荧光（Immunoflunence，IF）检测原代肌瘤及肌层细胞RECK蛋白的表达变化。继而采用Western Blot和免疫组织化学染色法（Immunohistochemical staining，IHC)检测RECK在肌瘤和肌层组织的表达差异及RECK蛋白的细胞定位。
　　结论：⑴miR-15b-5p mimic转染各型细胞24小时，与空白对照组相比，肌瘤细胞系和肌层细胞系 RECK mRNA表达下降（配对 t检验，P<0.05，P<0.001)。miR-15b-5pmimic转染各型细胞48小时，与空白对照组相比，子宫肌瘤细胞系、子宫肌层细胞系及原代子宫肌瘤细胞 RECK mRNA表达下降（配对t检验，P<0.01，P<0.001，P<0.001）。⑵使用10nM的miR-15b-5p mimic和inhibitor及各自阴性对照转染各型细胞48h。子宫肌瘤细胞系和原代子宫肌瘤细胞系转染miR-15b-5p mimic组与其阴性对照组相比，RECK蛋白表达显著下降；转染miR-15b-5p inhibitor组RECK蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义(配对t检验，P均<0.001)。子宫肌层细胞系转染miR-15b-5p mimic组与其阴性对照组相比，RECK蛋白表达显著下降（配对t检验，P<0.001)；转染inhibitor组RECK蛋白表达显著升高，差异具有统计学意（配对t检验，P<0.01)。原代子宫肌层细胞转染mimic RECK蛋白表达显著下降；转染inhibitor组RECK蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义（配对t检验，P<0.05)。⑶细胞和原代肌层细胞，转染inhibitor组转绿色荧光标记的RECK蛋白表达增多。⑷RECK蛋白在子宫肌层组织表达显著高于配对的子宫肌瘤组织（配对 t检验，P<0.001)。RECK蛋白在子宫肌层细胞表达显著高于配对的子宫肌瘤细胞(配对t检验，P<0.05)。⑸RECK蛋白表达位于子宫肌纤维细胞的胞浆，配对的子宫肌层组织较子宫肌瘤组织中RECK蛋白表达显著升高。

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英文缩略词表对照

引言

第一部分：子宫肌瘤组织差异表达microRNA的筛选研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二部分：miR-15b-5p过表达和低表达对子宫肌瘤细胞生物学特征的影响

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第三部分：miR-15b-5p调控子宫肌瘤细胞生物学特征的下游靶蛋白研究

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

全文结论

本课题创新点

参考文献

综述: MicroRNA参与子宫肌瘤发病的研究进展

个人简介及攻读博士学位期间发表的文章

致谢