基于血浆游离DNA高通量测序的原发性肝细胞癌的分子分型及其对肝癌TACE术后残癌或复发的早期预警

摘要

研究背景：
　　外科切除、肝移植术和局部消融是肝细胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC，以下简称肝癌）可能治愈的方法。对于晚期或进展期肝癌患者，临床以非手术治疗为主。经肝动脉化疗栓塞术（Transcatheter arterial chemoem-bolization， TACE）以微创、明确的疗效已成为临床非手术方案首选的治疗方法。TACE术后残癌及复发是影响肝癌远期疗效的瓶颈。因此，肝癌的早期筛查、诊断和治疗对于改善患者预后有重要的意义。特别是如何早期明确诊断 TACE术后残癌及复发，是当今面临的严峻问题。目前针对残癌的诊断及随访主要依靠血清学检测和影像学检查，其中以影像学检查为主。血清学检测最常见的是AFP检测。但临床证实AFP特异性、敏感性差，并且在不同的疾病进展状态下，AFP的高低并不能实时反应出肿瘤进展的真实情况。影像学检查对于位置深的小病灶或者低流速、乏血供病灶的诊断精确性较差。近年来研究表明，血浆游离DNA（cell free DNA，cfDNA）能有效反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基因突变信息，与肿瘤组织的基因信息呈一定相关性。通过对血浆cfDNA测序检测肿瘤相关的基因拷贝数变化、甲基化变化、染色体重排变化等已广泛应用于临床诊断、用药指导和检测肿瘤发生情况。文献报告，cfDNA的变异情况对肿瘤患者的辅助诊断价值优于传统肿瘤标志物，如CEA、CA199等，某些方面也优于影像学检查。但极少有相关的临床研究。
　　目前关于肝癌的治疗，主要依据是病理类型及肝癌分级。但临床发现，同一病理类型的肝癌，经过相同的治疗方案，其结果却差别很大。提示肝癌分子分型不同。依据分子分型进行个体化的精准治疗，是肝癌研究的热点，也是趋势。
　　因此，本研究旨在通过前瞻性研究，探索基于cfDNA的肝癌分子分型及其对肝癌TACE后残癌的早期预警。
　　研究目的：
　　评估基于第二代测序技术的cfDNA肿瘤相关基因变异检测是否可以用于分析肝癌的分子分型；观察肝癌患者在介入治疗过程中血浆cfDNA动态变异的出现，是否早于传统的实验室和影像学检查，并实时、客观反应肿瘤进展。
　　材料和方法：
　　本研究分为两个部分，第一部分，利用基于第二代测序技术的目标基因靶向测序技术，对41例肝癌患者的肿瘤组织DNA、血浆cfDNA和血细胞DNA中的21个肿瘤相关基因进行捕获测序。分析肿瘤组织DNA、血浆cfDNA和血细胞基因组DNA中的肿瘤相关突变基因及突变负荷率，比对出差异基因，以及差异基因的突变趋势。
　　第二部分选择接受TACE治疗的肝癌患者（包括早期和中晚期），定期检测和评估患者血浆cfDNA基因变异的情况，同时从临床症状、影像学检查、实验室检查（AFP）等方面进行随访，判断患者血浆 cfDNA动态变异的出现，是否早于传统的实验室和影像学检查，并实时反应肿瘤进展情况。
　　结果：
　　本研究的第一部分，在肝癌患者中驱动基因（PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53、ERBB4）的变异负荷率最大。在高频变异的基因中，血细胞DNA总体变异谱（基于变异频率）不同于肿瘤组织DNA和血浆游离DNA变异谱，而肿瘤组织DNA和血浆cfDNA变异谱较为接近，提示血浆cfDNA和肿瘤组织DNA中肿瘤相关基因变异的一致性较好。多发病灶的肝癌患者血浆游离 DNA中CTNNB1、PIK3CA、MET、EGFR、FBXMW7、EGFR、TP53、ERBB2基因变异负荷量较单发病灶患者高。AFP正常的患者中血浆cfDNA基因变异结果显示，在AFP正常的肝癌患者（AFP<20ng/ml）中CTNNB1、EGFR、ALK、BRAF、NOTCH1基因变异负荷量较高。
　　本研究的第二部分，在前期基础研究纳入的患者中，选取其中资料完善、随访规律的三例患者为观察对象，前瞻性的观察患者在介入治疗期间cfDNA动态变异情况。两例患者均为晚期肝癌，病灶为巨块型，伴多发小结节，门脉受侵犯伴有癌栓，均接受了3次TACE治疗。1例为早期肝癌患者。治疗前和治疗后一周期间，患者血浆 cfDNA中肿瘤驱动基因（NRAS、BRAF、PIK3CA、ARID1A、AXIN1、ARID2、TERT、TP53、CTNNB1基因）的变异负荷量未发生变化，而此期间 AFP是下降趋势，影像学评估为疾病缓解（PR）。治疗后1个月时，患者血浆cfDNA中肿瘤驱动基因的变异负荷量总体呈现上升趋势，提示肿瘤进展，但此时AFP仍然下降，患者影像学评估仍为疾病缓解。患者治疗后1个半月后时，AFP又明显升高，影像学此时评估为病变进展（PD）。另一例早期肝癌患者，cfDNA的变异负荷量的变化，也客观反映了肿瘤进展情况，早于影像学，并且在后期的治疗中得到了临床验证。
　　结论：
　　1.肝癌患者血浆cfDNA和肿瘤组织DNA中肿瘤相关基因变异的一致性较好。
　　2.多发病灶的肝癌患者血浆游离DNA中CTNNB1、PIK3CA、MET、EGFR、FBXMW7、TP53、ERBB2基因变异负荷量较单发病灶患者高。
　　3.在AFP正常的肝癌患者（AFP<20ng/ml）中 CTNNB1、EGFR、ALK、BRAF、NOTCH1基因变异负荷量较高。
　　4.在肝癌TACE术后残癌或复发早期预警方面，cfDNA变异负荷量的改变早于AFP和影像学的改变。

目录

声明

缩略词对照表

第一部分 基于cfDNA的原发性肝癌的分子分型研究

引言

研究内容

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 cfDNA对肝癌TACE术后残癌或复发的早期预警机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:基于游离DNA原发性肝细胞癌的分子分型及其对TACE术后残癌的伴随诊断研究进展

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢