LM609通过integrinανβ3-CXCR4/CXCR7生物学轴影响头颈鳞癌转移的分子机制及预后相关的基础研究

摘要

根据最新的美国癌症联合委员(American Joint Committee on Cancer，AJCC)会统计，头颈部鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck，SCCHN)已经成为世界上第6大常见恶性肿瘤，全球每年新发头颈部鳞癌大约40-50万例，且多为老年男性，每年约有10-15万人死于头颈部鳞癌。目前不同分期的头颈部鳞癌治疗方式不一样，总结起来就是手术、放化疗或其他辅助治疗。
　　正是因为中晚期头颈部鳞癌死亡率较高，死亡原因基本上都是局部侵犯和远处转移，所以越来越多的研究放在了如何抑制肿瘤细胞侵袭和转移上。最新研究发现，肿瘤细胞要想在在体液和组织间穿行，至少包括4个步骤（细胞随体液流动;细胞稳固黏附到血管内皮上;细胞穿过内皮细胞间隙以及细胞迁移到特定组织中），在此过程中，趋化因子(Chemokine)控制着被选择细胞的稳固黏附以及渗出细胞的选择性，使各种免疫细胞到达感染、创伤和异常增殖部位，从而执行促进创伤愈合、清除感染源、消灭异常增殖细胞和维持组织细胞平衡的功能。与趋化因子的作用类似，整合素(Integrin)粘附介导位置主要位于细胞与细胞外基质，细胞黏附首先为肿瘤细胞浸润转移提供前提条件，在肿瘤转移四个关键步骤中原发肿瘤细胞的脱落是由于肿瘤细胞间粘附性降低;肿瘤细胞的侵袭借助整合素粘附到基底膜，继而侵入循环系统;沿循环系统转移过程中，需要借助整合素的粘附作用再次特异地黏附到被选择器官的静脉内皮细胞上;穿出血管后再次粘附到靶器官的内皮基地部进行生长，在这四个总体步骤中，细胞的粘附能力是不断变化的，主要目的是促进肿瘤的转移，在此过程中细胞粘附能力的增加或是降低，都有可能直接或间接调节肿瘤细胞的转移能力，因此整合素的粘附介导功能功不可没，在此过程中趋化因子和整合素都扮演十分重要的角色。
　　趋化因子和整合素同属于跨细胞膜蛋白，趋化因子和整合素在恶性肿瘤领域的角色，最近几年越来越受到广大学者的广泛关注。目前国内外的不少研究越来越多的关注在整合素和趋化因子的研究上，更多的是分别研究各自的机理及分子生物学特性，关于两者的相互关系的研究不多。近期部分研究证实，整合素家族可以被某些趋化因子受体家族诱导激活，进而影响以整合素介导信号传导为基础的细胞部分功能，例如侵袭、转移、粘附、迁徙等功能改变。
　　目的：
　　本课题探讨integrinαvβ3在SDF-1-CXCR4/CXCR7介导的头颈部鳞癌转移过程中可能的作用，我们希望通过SDF-1对头颈鳞癌转移细胞PCI-13的诱导作用，以及integrinαvβ3特异性抑制剂LM609、CXCR4抑制剂AMD3100、CXCR7抑制剂CCX754的阻断作用来证明SDF-1是否可以激活integrinαvβ3-CXCR4/CXCR7信号通路，同时探LM609/AMD3100/CCX754对SCCHN的抑制逆转作用。一方面先分析integrinαvβ3、CXCR4、CXCR7在头颈部鳞癌原发灶、淋巴结转移灶、正常口腔黏膜组织以及正常淋巴结中的表达，以及对高表达的SCCHN患者进行UN-QOL和PSS-HN生存质量评估，初步探讨三者之间的相关性，再从全局角度出发，证实在PCI-13 SCCHN细胞系的体外实验中，通过一系列试验，验证SDF-1在SCCHN细胞系PCI-13中能否激活integrinαvβ3的表达;另一方面单从整合素自身角度出发，运用特异性抑制剂LM609/AMD3100/CCX754对SCCHN细胞系PCI-13转移方面的抑制拮抗作用，为头颈部鳞癌的靶向治疗药物的研发，提供一定的理论依据。
　　方法：
　　1.采用免疫组化SABC法分析integrinαvβ3、CXCR4、CXCR7在头颈部鳞癌原发灶、淋巴结转移灶、正常头颈部黏膜组织以及正常淋巴结中的表达情况，收集入组患者的一般统计学资料。
　　2.采用甲基偶氮哇盐光吸收法(MTT)检测SDF-1和LM609/AMD3100/CCX754对SCCHN PCI-13细胞增殖能力的影响。
　　3.采用流式细胞法检测SDF-1和LM609/AMD3100/CCX754对SCCHNPCI-13细胞integrinαvβ3表达能力的影响。
　　4.采用Western-Blot实验测定SDF-1和LM609/AMD3100/CCX754对SCCHNPCI-13细胞蛋白表达能力的影响。
　　5.采用人造组织创口划痕实验和Transwell小室法测定SDF-1和LM609/AMD3100/CCX754对SCCHN PCI-13细胞迁移能力的作用。
　　6.采用Transwell小室加Martrigel测定SDF-1和LM609/AMD3100/CCX754对SCCHN PCI-13细胞侵袭能力的影响。
　　7.采用荧光倒置显微镜观察FITC/Phalloidin/PI三染后SDF-1和LM609/AMD3100/CCX754对SCCHN PCI-13细胞骨架改变能力的作用。
　　8.采用PSS-HN和UW-QOL量表，对CXCR4/CXCR7/integrinαvβ3高表达头颈部鳞癌患者生存率和术后缺损的生活质量进行评估，对照组采用CXCR4/CXCR7/integrinαvβ3低/无表达的患者。
　　结果：
　　1.integrinαvβ3/CXCR4/CXCR7染色同样主要位于SCCHN细胞胞浆和细胞膜，并且表达的强弱与肿瘤大小、淋巴结转移、有无周围组织侵犯有统计学意义，与患者年龄、性别等一般资料无统计学意义。
　　2.MTT结果显示SCCHN细胞系PCI-13的增殖速度，经过SDF-1诱导后，有明显增高，但是经过LM609/AMD3100/ CCX754抑制后，细胞增殖率明显下降，但是各自的抑制率有各不相同，AMD3100/与CCX754细胞抑制率类似，LM609抑制率高。
　　3.流式细胞仪检测发现integrinαvβ3和CXCR4/CXCR7，均在PCI-13中高表达，并且表达位于细胞的胞膜和胞浆中。并且流式细胞和Western-Blot检测证实SCCHN细胞系PCI-13的integrinαvβ3表达，经过SDF-1诱导后，有明显增高，但是经过LM609/AMD3100/CCX754抑制后，PCI-13的integrinαvβ3表达水平明显下降。
　　4.划痕实验和Transwell小室实验发现PCI-13经SDF-1诱导刺激后，PCI-13细胞的迁移能力明显增强，与空白对照组相比，28H/48H的划痕宽度明显降低;但是PCI-13细胞经过LM609/AMD3100/CCX754抑制后，划痕宽度较SDF-1诱导组明显改变，但是各自的抑制率又各不相同，AMD3100/与CCX754细胞抑制率类似，LM609抑制率高。同样在Transwell小室测定细胞侵袭实验结果，也与上述结果类似。
　　结论：
　　1.integrinαvβ3/CXCR4/CXCR7染色同样主要位于SCCHN细胞胞浆和细胞膜，并且表达的强弱与肿瘤大小、淋巴结转移、有无周围组织侵犯有统计学意义，与患者年龄、性别等一般资料无统计学意义。integriαvβ3/CXCR4/CXCR7在头颈部鳞状细胞癌原发灶和SCCHN淋巴结转移灶的表达具有正相关性，为进一步探讨integrinαvβ3/CXCR4/CXCR7参与SCCHN淋巴结转移的具体机制，提供了一定的理论基础并且奠定了一定的实验基础。
　　2.CXCR4-integrinαvβ3信号传导轴与CXCR7-integrinαvβ3信号传导轴均可通过SDF-1的诱导，促使integrinαvβ3的表达增加。LM609明显抑制了SDF-1对integrinαvβ3表达的诱导增加作用。
　　3.CXCR4-integrinαvβ3与CXCR7-integrinαvβ3信号传导轴均可通过SDF-1的诱导，促使头颈部鳞癌细胞淋巴结转移的关键步骤例如增殖、趋化、侵袭作用的增加，并且这种诱导增加作用可以被LM609明显抑制。
　　4.LM609与AMD3100/CCX754的抑制作用不同，并且更换前后抑制顺序后，LM609的抑制作用表现更为突出，提示了integrinαvβ3可能是CXCR4/CXCR7-integrinαvβ3信号传导轴的下游信号。
　　5.integrinαvβ3/CXCR4/CXCR7高表达的SCCHN患者，利用PSS-HN和UW-QOL量表对其缺损修复重建后生存质量评估得分，高于integrinαvβ3/CXCR4/CXCR7中-低表达的SCCHN患者，其淋巴结转移率高，3年生存率略低。
　　6.PSS-HN和UW-QOL量表对SCCHN皮瓣修复术后评分发现，外观满意度得分最高，言语满意度得分最低，其次是吞咽进食功能，在一定程度上说明术后缺损修复在外形上的成功，但是在具体使用功能上还有待提高。
　　7.integrinαvβ3/CXCR4/CXCR7三者表达高低的不同，与预后生存质量评分高低和生存率有密切关系，有助于我们术前评估手术范围，以及术后病人随访观察时间，直接或间接的影响着患者的诊治和预后。

目录

声明

摘要

英文索引

LM609通过integrin αvβ3-CXCR4／CXCR7生物学轴影响头颈鳞癌转移的分子机制及预后相关的基础研究

前言

第一部分 Integrin αvβ3／CXCR4／CXCR在头颈部鳞状细胞癌及其淋巴转移灶中的表达及临床意义

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 结论

5 参考文献

第二部分 LM609通过SDF1-CXCR4／CXCR7生物学轴介导影响头颈鳞癌转移的分子机制

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

6 参考文献

第三部分 PSS-HN和UW-QOL量表对CXCR4／CXCR7／integrin αvβ3高表达头颈部鳞癌缺损修复重建后生存质量评估

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

5 结论

6 参考文献

综述

个人简历、发表的学术论文与研究成果

致谢