体外受精胚胎移植助孕早期自然流产相关因素分析及ALK5在其过程中的作用研究

摘要

一、体外受精胚胎移植妊娠后早期自然流产因素分析
　　研究目的：
　　探讨在体外受精胚胎移植助孕(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF/intra-cytoplasmic sperm injection, ICSI)临床妊娠后，和早期自然流产的相关临床因素分析，为提高IVF/ICSI活产率提供理论依据和帮助。
　　研究方法：
　　本回顾性分析自2010年-2016年于郑州大学第一附属医院生殖医学中心进行IVF/ICSI助孕，并获得临床妊娠的21,485个助孕周期的临床资料。本研究的主要指标是IVF/ICSI助孕获得临床妊娠后的早期自然流产率，其中不包括因多胎妊娠行人工减胎术后的流产率。
　　本研究首先按照患者的不同年龄阶段、不同体重指数、既往流产次数、各种不孕因素、新鲜周期/解冻周期、移植日子宫内膜厚度以及各种治疗方案对患者进行分组，然后比较各组患者早期自然流产率的差异。然后，我们按照年龄对所有患者进行分层，并且以男方因素不孕患者为对照组，着重比较PCOS、子宫畸形以及子宫内膜异位症患者的早期自然流产率的情况。最后，我们探讨在不同年龄阶段，控制其他影响因素之后，新鲜周期和解冻周期移植对早期自然流产率的影响。
　　结果：
　　1．在本研究纳入的21,485个临床妊娠周期中，早期自然流产共2,703个周期，早期流产发生率为12.58％。
　　2．在35岁以下，35-40岁和40岁以上的人群中，早期自然流产率分别为10.61%(1844/17377)，17.83%(591/3314)和33.75%(268/794)，差异具有统计学意义（P=0.000）。
　　3．随着女方 BMI的升高，自然流产的发生率也明显增高， BMI在小于20Kg/m2，20-25 Kg/m2以及25 Kg/m2以上的人群中，自然流产率分别为10.61%(497/4685)，12.52%(1570/12543)和14.94%(636/4257)，差异也具有明显的统计学意义（P=0.000）
　　4．随着女方既往自然流产次数的增加，在行IVF/ICSI助孕获得妊娠后自然流产的风险明显增高。若女方有3次及以上的流产病史，则在助孕妊娠后，自然流产的发生率高达19.22%（163/848）。
　　5．IVF/ICSI助孕临床妊娠后，早期自然流产率随着内膜厚度的减少而有增高趋势，在移植日子宫内膜厚度为小于8mm，9-13mm和14mm以上的人群中，自然流产率分别为17.09%(350/2048)，12.55%(1930/15378)和10.42%(423/4059)， P=0.000。
　　6．在年龄在35岁以下的患者中，和男方因素的患者相比，子宫畸形患者和PCOS患者的自然流产率均明显升高，差异具有统计学意义（14.44%vs9.47%， P=0.027；11.43% vs9.47%，P=0.003）；而子宫内膜异位症患者的自然流产率和对照组无明显差异（10.18%vs9.47%，P=0.519）。在年龄35岁以上的高龄组患者中，和对照组相比，子宫畸形组和子宫内膜异位症组患者的自然流产率虽有升高趋势，但差异不具有统计学意义（25.64% vs17.79%，P=0.223；21.74% vs17.79%，P=0.209）。但是，对于PCOS患者而言，其自然流产率反而有低于对照组的趋势（17.63%vs17.79%）。
　　7．在控制其他相关影响因素之后，Logistic回归分析显示，在<35岁的患者中，解冻移植有增高自然流产的作用（OR=1.449，95%CI=1.303-1.611，P=0.000）；而在≥35岁中，和新鲜周期移植相比，解冻移植则是自然流产的一个保护因素（OR=0.794，95%CI=0.671-0.939，P=0.007）。
　　结论：
　　1．在进行IVF/ICSI治疗过程中，早期自然流产主要和女方年龄，BMI，既往流产次数，不孕因素，移植日子宫内膜厚度等因素有关。
　　2．和单纯男方因素相比，在年龄<35岁的患者中，PCOS和子宫畸形显著增加妊娠后早期自然流产的发生率，而子宫内膜异位症则对自然流产的影响不显著；对于年龄在35岁以上的患者，以上三种疾病对自然流产率的影响意义不显著。
　　3．年龄，既往流产次数以及移植日子宫内膜厚度是自然流产率的独立影响因素。在年龄<35岁的患者中，解冻周期移植增加自然流产的发生率；而在年龄≥35岁的患者中，解冻周期反而降低自然流产的发生率。
　　二、ALK5在胚胎停育患者蜕膜组织中的表达及临床意义
　　研究目的：
　　本研究的研究对象包括正常妊娠因个人原因而行人工流产的蜕膜组织和IVF/ICSI助孕临床妊娠后早期自然流产的蜕膜组织，比较ALK5在两组患者蜕膜组织中的表达差异，探讨ALK5在自然流产中的作用。
　　研究方法：
　　收集2013年8月至2014年8月郑州大学第一附属医院生殖医学中心门诊和妇科门诊手术室分别因胚胎停育和正常妊娠但自愿行人工流产患者的蜕膜组织标本，收集时机为孕6-8周。分别用免疫组织化学、实时定量PCR和Western Blotting技术手段检测ALK5在两组患者的蜕膜组织中的mRNA和蛋白表达情况。
　　结果：
　　1.和正常妊娠患者相比，早期自然流产患者的平均年龄（（27.72岁 vs28.05岁，P>0.05）和孕周（6.82周 vs6.56周，P>0.05）均无统计学差异。
　　2. ALK5在两组患者的蜕膜组织中均有不同程度的阳性表达，阳性部位呈棕黄色或棕褐色染色，主要定位于蜕膜细胞的胞浆中；但 ALK5在早期自然流产的蜕膜组织中阳性表达率较低（30.0%=6/20），而在正常妊娠蜕膜组织的阳性表达率较高（83.3%=15/18）。
　　3.和正常妊娠蜕膜组织中ALK5的表达量相比，自然流产组蜕膜中ALK5的mRNA和蛋白水平均明显降低。
　　结论：
　　ALK5在自然流产蜕膜组织中的表达显著低于正常妊娠蜕膜组织，提示ALK5在维持正常妊娠的过程中发挥了一定作用，表达降低可能通过某些机制影响妊娠维持，从而导致早期流产。
　　三、ALK5在子宫内膜基质细胞体外蜕膜化过程中的表达
　　研究目的：
　　首先，本研究通过cAMP和MPA的方法，在体外成功的建立了人类子宫内膜基质细胞蜕膜化的模型，观察ALK5在体外蜕膜化过程中不同时间点的表达规律，为胚胎着床障碍及习惯性早期自然流产的研究提供更多的理论依据。
　　研究方法：
　　本研究通过运用8-Br-cAMP和MPA对人类的子宫内膜基质细胞进行体外蜕膜化的处理，并且以此为模型，收集蜕膜化处理后D0，D1（24小时），D2（48小时）和D4（96小时）的细胞，采用实时定量PCR和Western Blotting的方法，在mRNA和蛋白水平检测ALK5在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中的表达变化。
　　结果：
　　1.人子宫内膜基质细胞在体外蜕膜化的过程中，基质细胞最初的形态为细长的梭形，然后逐渐转变为较大的多角形；另外其胞体变大、变圆，而胞核变大变淡，细胞和细胞之间的界限也逐渐变得模糊不清。
　　2.在体外蜕膜化过程中，子宫内膜基质细胞分泌的PRL水平逐渐升高；同时，在体外蜕膜化处理后的96小时，PRL的分泌达到峰值，显著高于蜕膜化初始时。
　　3.实时定量PCR结果表明，ALK5的mRNA水平在体外蜕膜化过程中呈逐渐上升的趋势，差异具有统计学意义（D0，D1，D2，D4分别1.0，1.9，2.2和4.1；P<0.01）；而Western Blotting结果显示，ALK5的蛋白水平在体外蜕膜化过程中也呈逐渐上升的趋势，差异具有统计学意义（D0，D1，D2，D4分别0.4，1.2，1.5和2.1；P<0.01）。
　　结论：
　　1．运用本研究采取的体外蜕膜化方法对子宫内膜基质细胞进行处理，在体外蜕膜化的第2天可出现明显的蜕膜化改变，在处理之后的第4天达到理想水平，是对蜕膜化进行研究的理想体外模型。
　　2．ALK5在子宫内膜基质细胞体外蜕膜化过程中的表达具有一定的规律性，提示 ALK5可能在子宫内膜基质细胞蜕膜化和妊娠维持过程中起到重要的调节作用。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

第一部分 体外受精胚胎移植妊娠后早期自然流产因素分析

1 资料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 ALK5在胚胎停育患者蜕膜组织中的表达及临床意义

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三部分 ALK5在子宫内膜基质细胞体外蜕膜化过程中的表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文小结

创新点

综述一:自然妊娠后早期自然流产常见因素分析

综述二:转化生长因子及其受体在女性生殖系统中的作用

个人简历

攻读博士学位期间发表文章情况

致谢