乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性与肝癌发生的关系

摘要

肝癌（liver cancer）是最常见威胁人类健康的肝脏恶性肿瘤。肝炎-肝硬化-肝癌，这一发展模式得到支持。肝纤维化是各种慢性肝病共同的病理学特征，也是慢性肝病进展到肝硬化的必经阶段。
　　乙醇脱氢酶（ alcohol dehydrogenases, ADH）和乙醛脱氢酶（ aldehyde dehydrogenases, ALDH）主要存在于肝细胞中。ADH主要参与乙醇代谢，乙醇经氧化生成乙醛，乙醛具有肝脏毒性，能诱发癌症。同时ADH也参与视黄醇代谢，视黄醇及其代谢物参与肝炎及肝纤维化的进程，近期结果也显示ADH的缺乏能抑制肝纤维化。
　　据报道，和癌旁的正常组织相比，肝癌组织中 ADHI活性出现升高。肝癌患者血清中ADH活性较健康人也出现升高。本室前期结果显示，和正常肝组织相比，肝癌患者的肝纤维化组织中总ADH、ADHI、ADHII酶活性均明显升高，而总ALDH和ALDH2酶活性没有改变。
　　上述结果显示，ADH活性升高可能和肝纤维化甚至肝癌存在关系，但肝癌发展的各个阶段血清和组织中 ADH活性是如何改变的，ADH活性的升高是肝损伤的结果还是原因，其升高是否存在对肝损伤的易感性有待实验进一步研究。
　　本实验拟选择二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine, DEN）制备的大鼠肝癌模型为研究对象，测定大鼠在诱导的不同阶段 ADH活性，分析大鼠血浆中 ADH基础活性和肝损伤相关指标的相关性，并分析肝组织中ADH、ALDH活性和肝损伤相关指标的相关性，以期探讨ADH在肝纤维化甚至肝癌发展中所起的作用。
　　方法：
　　1.大鼠肝癌模型建立
　　1.1.动物分组和给药方法
　　54只SD雄性大鼠，分成2组，对照组10只，模型组44只，适应性喂养后，模型组1-4周腹腔注射50 mg/kg DEN，每周两次，5-14周改为腹腔注射50 mg/kg DEN，每周一次，在诱导至12周时随机处死20只模型组大鼠，命名为模型 A组。剩余大鼠继续按照上述方法给药，14周给药结束后继续饲养，于19周处死，此组大鼠命名为模型B组。对照组10只大鼠在19周处死。
　　1.2.动物观察与取材
　　每天观察大鼠生理和精神状态，每周记录大鼠体重，对照组和模型 B组于给药前第0周，及开始给药后第8、12、16、19周留取大鼠血浆。模型A组于给药前第0周，及开始给药后第8、12周留取大鼠血浆。大鼠处死后，取出肝脏，肝组织一部分进行病理检查，剩余部分放入液氮。
　　1.3.肝匀浆的制备及蛋白浓度测定
　　称取适量肝组织，加入9倍体积的匀浆介质，制成10％组织匀浆，离心取上清，用BCA法测定肝匀浆蛋白浓度。
　　1.4.血浆和肝匀浆中ALT、AST活性测定
　　血浆和肝匀浆中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性参照试剂盒说明书通过酶标仪测定。
　　1.5.肝组织病理染色测定
　　对照组和A、B模型组大鼠肝组织切片进行HE、masson染色，并根据Ishak评分系统对肝标本进行分级，并测定了masson染色后纤维化面积占比。
　　1.6.肝组织免疫组化测定
　　通过免疫组化方法测定对照组和A、B模型组大鼠细胞增殖指数（Ki67）、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA）、胎盘型谷胱甘肽硫转移酶（Glutathione S-transferase placental form, GST-p）蛋白的表达水平和表达位置。
　　2.血浆ADH和肝匀浆ADH、ALDH活性测定
　　ADH催化氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）反应生成还原型辅酶I（NADH），NADH在340 nm处有吸收，通过测定340 nm处吸光度变化得到ADH活性，血浆和肝匀浆中ADH活性用此原理的试剂盒测定。ALDH催化NAD+反应生成NADH，测定340 nm处吸光度变化得到ALDH活性。肝匀浆中ALDH活性用此原理试剂盒测定。
　　3.统计方法
　　采用SPSS17.0软件对各项数据资料进行统计学分析。两组间数据的比较采用独立样本t检验，三组及三组以上数据的比较用单因素方差分析，ADH、ALDH活性、ADH/ALDH与肝损伤相关指标间的相关性采用Person相关，检验水准α为0.05。
　　结果：
　　1.大鼠肝癌模型建立
　　1.1.大鼠体重肝重
　　与对照组相比，模型组大鼠体重从诱模第2周到处死时均下降（P<0.001）。和对照组相比，模型 A组肝重无明显改变（ P>0.05），肝重/体重明显升高（P<0.001）；模型B组大鼠肝重升高（P<0.001），肝重/体重升高（P<0.001）。
　　1.2.大鼠存活情况
　　模型组大鼠在诱导的前12周无死亡，在15-19周陆续死亡14只。
　　1.3.血浆和肝匀浆中ALT、AST活性
　　与对照组相比，在8、12、16和19周模型组大鼠血浆中ALT、AST活性均有明显升高（P<0.001）。与对照组相比，模型 A组大鼠肝匀浆中 ALT活性下降（P<0.05），模型B组大鼠肝匀浆中ALT活性下降更明显（P<0.01）；与对照组相比，模型A组大鼠肝匀浆中AST活性升高（P<0.05），模型B组大鼠肝匀浆中 AST活性升高更明显（P<0.01）；与对照组相比，A、B模型组 AST/ALT比值均升高（P<0.001）。
　　1.4.病理染色结果和成癌率
　　与对照组相比，A、B模型组大鼠肝组织Ishak评分和masson染色后纤维化所占面积均明显升高（P<0.001）。
　　模型 A组（12周处死）大鼠均出现不同程度的肝纤维化。模型 B组（19周处死）有5只大鼠出现肝腺瘤，9只出现肝细胞癌，成癌率为66.7%。
　　1.5.肝损伤相关指标的结果
　　与对照组相比，A、B模型组大鼠肝脏切片中 Ki67、PCNA阳性细胞率和GST-p平均光密度值均增加（P<0.01）。与模型A组相比，模型B组Ki67和PCNA阳性细胞率下降（P<0.01），GST-p平均光密度值无明显改变（P>0.05）。
　　2.大鼠ADH、ALDH活性
　　2.1.大鼠血浆中ADH活性
　　与对照组相比，模型组大鼠血浆中ADH活性在16周（24.21±9.86 U/ml）和19周（24.56±9.65 U/ml）升高（P<0.05），在0、8、12周无明显改变（P>0.05）。
　　2.2.大鼠肝匀浆中ADH、ALDH活性
　　与对照组大鼠肝匀浆中ADH活性(3.43±1.07 U/mg prot)相比，大鼠肝匀浆ADH活性在模型A组（4.50±1.05 U/mg prot）、B（4.77±2.11 U/mg prot）组均升高（P<0.05）；对照组大鼠肝匀浆中ALDH活性为9.96±1.52 U/g prot， A、B模型组大鼠肝匀浆中ALDH活性分别为46.02±14.10 U/g prot和30.33±9.80 U/g prot，较对照组显著升高（P<0.001），与模型A组相比，模型B组大鼠肝匀浆中ALDH活性下降34.1%（P<0.001）。
　　3.大鼠ADH、ALDH和肝脏损伤相关指标的关系
　　3.1.大鼠ADH基础活性和肝脏损伤相关指标的关系
　　模型A组大鼠第0周血浆中ADH基础活性和12周测定的4个肝脏损伤相关指标有相关性（masson面积%，Ki67+%，PCNA+%，GST-p平均光密度值），相关系数分别为0.453、0.512、0.457、0.450（P<0.05）。而模型B组大鼠血浆中ADH基础活性和19周测定的肝脏损伤相关指标不存在相关性（P>0.05）。
　　3.2.大鼠肝匀浆中ADH、ALDH活性和和肝脏损伤相关指标的关系
　　模型B组大鼠肝匀浆中ADH活性和19周测定的5个肝脏损伤相关指标（肝重/体重，结节数量，结节最大直径，结节累积直径，Ki67+%）有相关性，相关系数分别为0.567、0.499、0.438、0.626、0.506（P<0.05）。模型 B组肝匀浆中ADH/ALDH和19周测定的4个肝脏损伤相关指标（肝重/体重，结节数量，结节最大直径，结节累积直径）存在相关性，相关系数分别为0.720、0.476、0.522、0.755（P<0.01）。
　　结论：
　　1.模型组大鼠血浆中ADH活性在16周和19周较对照组升高，肝匀浆中ADH活性在12周和19周较对照组升高。
　　2.12周和19周DEN诱导的肝癌模型大鼠肝匀浆中ALDH活性较对照组升高。
　　3.大鼠血浆中ADH基础活性升高是肝纤维化的易感因素。

目录

声明

中英文对照缩略词表

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 大鼠肝癌模型的建立

2 模型大鼠各阶段ADH、ALDH活性的改变

3 大鼠ADH、ALDH活性与肝损伤相关指标的关系

讨论

结论

参考文献

综述:乙醇代谢酶和CYP2E1在酒精及非酒精肝疾病中的作用

个人简历

致谢