人自体PBMC对反复种植失败患者子宫内膜容受性标志物及胚胎着床的影响

摘要

背景及目的：
　　由于不孕症发病率逐渐升高，辅助生殖技术(ART)迅速发展，体外受精-胚胎移植(invitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技术使众多不孕症患者借助获得了后代[1]。其中一大部分夫妇在经历过几次IVF治疗后仍然不能成功妊娠，导致了严重的生活质量下降，并且每一次失败都会带来巨大的财务负担。反复着床失败(repeated implantation Failure，RIF)已成为辅助生殖领域研究的热点和难点[2]。胚胎成功着床的关键因素在于母体和胚胎之间的良好对话[3]，因此如何改善胚胎质量、提高子宫内膜容受性，促进母胎对话和免疫耐受成为了辅助生殖领域治疗RIF的主要研究方向。
　　最近Yoshioka等[4]首先报道了对反复着床失败患者进行宫腔灌注人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，结果显示反复着床失败患者的临床妊娠率、着床率和活产率得到了显著提高。PBMC主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核细胞。PBMC分泌的IL-1α、IL-1β和TNF-α等细胞因子在胚胎着床中发挥着重要作用[5]。其机制可能与PBMC分泌的多种炎性因子在内膜容受性上调和提高胚胎侵袭力有关。本课题通过体外培养实验和临床随机对照试验研究:
　　1.体外培养条件下自体PBMC对RIF患者子宫内膜容受性标志物人白血病抑制因子LIF和整合素αVβ3表达的影响;
　　2.PBMC对胚胎表面LIF受体表达的影响;
　　3.研究自体PBMC宫腔灌注对RIF患者行冻融胚胎复苏移植(Frozen-thawed embryo transplantation,FET)助孕妊娠结局的影响。
　　研究方法：
　　1、体外培养条件下自体PBMC对RIF患者子宫内膜容受性标志物LIF和整合素αVβ3表达的影响
　　1)选择2015年5月至2016年5月于郑州大学第二附属医院反复种植失败患者12例，使用内膜取样器收集患者月经第14天子宫内膜组织，分离子宫内膜腺上皮和间质细胞，体外培养传至2-3代后冷冻保存。同时收集其外周血使用Ficoll分离液分离出PBMC细胞。
　　2)以1×105个/ml密度将子宫内膜细胞接种于四孔板，37℃，5％CO2培养24h后，更换含雌孕激素培养液1ml，加雌孕激素培养液当日记作Day0。
　　3)体外培养至Day2时，实验组加入以密度为3×106/ml的PBMC细胞悬液0.5ml。对照组加入等量培养液。继续体外培养至Day6。
　　4)隔日换液，并分别于Day1、3、5收取培养上清液待测。
　　5)应用酶联免疫法检测培养液中LIF和整合素αVβ3的浓度。
　　2、PBMC对体外胚胎和子宫内膜共培养模型中胚胎表面LIF受体表达的影响
　　1)收集签署废弃胚胎知情同意书的胚胎，其中Day3胚胎共58枚。
　　2)用含雌孕激素的培养液体外培养子宫内膜细胞，模拟人体子宫内膜环境，加雌孕激素培养液当日记作Day0。
　　3)A组(实验组):培养至Day2时，观察子宫内膜贴壁情况，实验组加入以密度为3×106/ml的PBMC细胞0.5ml，Day3加入胚胎，共24枚，每孔2枚，养至Day6，观察囊胚形成情况。
　　4)B组(对照组):培养至Day2时添加等量培养液，Day3加入胚胎，共24枚，每孔2枚，养至Day6，观察囊胚形成情况。
　　5)C组(普通胚胎组):共10枚，不进行培养，将胚胎复苏后直接进行检测。
　　6)应用免疫荧光方法检测细胞期胚胎和囊胚表面LIFR的表达情况。
　　3、自体PBMC宫腔灌注对RIF患者FET妊娠结局的影响
　　1)研究对象:选取2015.1月至2016.12来我院生殖中心就诊的符合反复种植失败诊断的患者。
　　2)分组情况:将符合纳入条件的患者根据就诊时间排序并编号后，应用随机数表法进行随机分组，随机分为实验组和对照组，截至2016年12月，共入组78例，实验组A(56例)和对照组B(22例)。设置双盲，研究对象和主治医师均不知情分组情况。
　　3)实验组于主导卵泡破裂日或服用雌激素内膜厚度达到标准后进行孕酮转化当日抽取自体外周血4 ml，分离PBMC，方法同第一部分，分别于移植前1天、3天B超引导下用胚胎移植管将200ulPBMC细胞悬液轻轻注入宫颈内口上方。适时胚胎移植，保胎治疗。对照组宫腔灌注等量培养液，适时胚胎移植并保胎移植。
　　4)胚胎移植35日后行彩超检查，超声下看到孕囊胎芽为临床妊娠。
　　结果：
　　1、体外培养条件下自体PBMC对RIF患者子宫内膜容受性标志物LIF和整合素αVβ3表达的影响
　　1)培养第3天两组培养液中LIF浓度无明显差异(P＞0.05)，培养第5天时，与单独子宫内膜组相比，共培养组培养液中LIF浓度明显升高(P＜0.05)。
　　2)培养第3天两组培养液中整合素αVβ3浓度无明显差异(P＞0.05)，培养第5天时，与单独子宫内膜组相比，共培养组整合素培养液中αVβ3浓度明显升高(P＜0.05)。
　　2、PBMC对体外胚胎和子宫内膜共培养模型中胚胎表面LIF受体表达的影响
　　1)本研究共检测D3胚胎10枚，为4/Ⅱ—9/Ⅱ，对照组囊胚10枚，级别为3BB-5BB，实验组共获得12枚囊胚，级别为3BB-5BB。实验组和对照组囊胚形成率分别为:50.0％，41.7％，差异无统计学意义(P＜0.05)。
　　2)三组免疫荧光OD值差异显著P＜0.05;两两比较结果显示:LIFR的免疫荧光OD值实验组囊胚＞对照组＞单独胚胎组，P均＜0.05。
　　3、自体PBMC宫腔灌注对RIF患者行FET助孕的妊娠结局
　　1) PBMC治疗组和对照组的平均年龄、不孕年限、不孕类型、既往移植周期数、既往移植优胚数等相比，均无统计学差异(P＞0.05)。
　　2) PBMC治疗组的胚胎种植率和临床妊娠率均高于对照组(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.自体PBMC可以提高RIF患者子宫内膜细胞体外培养条件下LIF和整合素αVβ3的浓度，进而上调子宫内膜容受性。
　　2.PBMC可以促进子宫内膜共培养条件下的胚胎表面LIF受体的表达。
　　3.自体PBMC宫腔灌注可以提高RIF患者行FET助孕的胚胎种植率和临床妊娠率。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

前言

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计分析

结果

1 子宫内膜细胞体外生长情况

2 两组培养液中LIF因子的浓度

3 两组培养液中整合素αVβ3的浓度

4 共培养体系囊胚形成情况

5 免疫荧光检测结果

6 自体PBMC宫腔灌注干预RIF患者基本情况

7 PBMC干预组和对照组行FET助孕妊娠结局的比较

讨论

1 体外培养条件下自体PBMC对RIF患者子宫内膜容受性标志物LIF和整合素αVβ3表达的影响

2 PBMC对体外胚胎和子宫内膜共培养模型中胚胎表面LIF受体表达的影响

3 自体PBMC宫腔灌注对RIF患者行FET助孕妊娠结局的影响

结论

参考文献

综述

个人简历、在研究生期间发表的学术论文及研究成果

致谢